检测i型志贺毒素双抗夹心法酶联免疫试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及试剂盒领域，具体涉及一种检测I型志贺毒素（StXl)双抗夹心酶联免 疫检测试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 肠出血性大肠杆菌感染是一种食物源性传染性疾病，国外俗称为"汉堡病"，其病 原为肠出血性大肠杆菌（EnterohemorrhagicE.coli，EHEC)，其典型菌株为EHEC0157:H7， 主要表现症状为出血性结肠炎、阑尾炎、食管狭窄和结肠穿孔等严重胃肠道并发症，在儿童 和老年人中还可引起溶血性尿路综合症（haemolyticuraemicsyndrome，HUS)和血栓性血 小板紫癜（thrombocytpenicpurpura，TTP)等全身性并发症。HUS和TTP的病情凶险，病 死率高。据报道，由于0157 :H7感染力强，耐酸，100-200个0157细菌就能突破胃酸屏障，在 肠道内大量繁殖，引起人感染此病，而其它致病性大肠杆菌需要100万个细菌以上才能引 起发病。由于该菌对人的致病力强、可造成后遗症、预后差和目前国内外尚无特效疗法而引 起世界各国的高度重视。
[0003] 研宄表明，EHEC感染的主要致病机理可分为两个方面，一是由菌体基因组毒力 岛LEE(LocusofEnterocyteEffacement)编码的多种致病因子所介导的粘附抹平机制 (AttachingandEffacing,A/E)，通过A/E机制，细菌可破坏肠上皮细胞，粘附并定植于肠 道；二是分泌志贺毒素（Shigatoxin,Stx)，Stx可以穿越破损的肠上皮细胞进入血液循 环，与其受体-丙糖酰基鞘氨醇Gb3或丁糖酰基鞘氨醇Gb4结合，造成肠道、中枢神经系统 等器官的损伤，特别是Gb3受体含量较高的肾脏，受损后易引发HUS，危及生命；该毒素分 为StxI和StxII两个亚型。针对志贺毒素的研宄，以往主要集中在StxII上，因为临床上 StxII较StxI更能引起HUS。然而，由StxI引起的HUS还是经常被报道，本发明制备的抗 体及检测试剂盒填补了此方面的空白。
[0004] 临床上检测〇157:H7的常用方法包括细菌的分离培养法、免疫学方法、PCR扩增技 术。细菌培养发展得比较成熟，因其所需设备要求不高，己成为基层最常用的方法，但操作 复杂、费时，不能做到早期诊断。PCR虽然快速、敏感性和特异性高，但需特异性基因，目前除 rfbE基因特异性较高外，大部分与其他微生物具有一定的同源性，特异性还不理想。免疫 学方法因其灵敏性、特异性和可视性广泛用于临床疾病的诊断与监测，特别是ELISA检测， 敏感性高、操作简便，配套仪器设备的发展使操作程序规范化和自动化，并进一步提高了稳 定性，被广泛用于检测多种病原体抗原或抗体、血液及其它体液中微量蛋白成分、细胞因子 等。但是目前免疫学方法检测〇157:H7的候选抗体尚不理想。
[0005] 为了提供一种以StxI为靶向的快速、易操作的诊断EHEC感染的方法，本发明制备 多株针对StxI的单克隆抗体，从中筛选出非竞争性的两株单抗，分别为8E7-E6和2F6-F8， 制备双抗体夹心法ELISA试剂盒。本发明制备的双抗体夹心法ELISA试剂盒能够特异性检 测Stxl，具有很好的临床应用价值。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种抗StxI的单克隆抗体或其片段，包括轻链⑶R1-3和 重链⑶R1-3,其特征在于，所述轻链⑶R1-3的氨基酸序列为：
[0007] CDRl :如序列表中SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :11 所示；
[0008] CDR2 :如序列表中SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :12 所示；
[0009] CDR3 :如序列表中SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :13 所示；
[0010] 进一步，所述轻链⑶R1-3的核苷酸序列为：
[0011] CDRl :如序列表中SEQ ID NO :46或SEQ ID NO :52 所示；
[0012] CDR2 :如序列表中SEQIDNO :47 或SEQIDNO :53 所示；
[0013] CDR3 :如序列表中SEQ ID NO :48或SEQ ID NO :54 所示；
[0014] 所述重链⑶R1-3的氨基酸序列为：
[0015]CDRl :如序列表中SEQIDNO :4 或SEQIDNO : 14 所示；
[0016]CDR2 :如序列表中SEQIDNO :5 或SEQIDNO : 15 所示；
[0017]CDR3 :如序列表中SEQIDNO :6 或SEQIDNO :16 所示。
[0018] 进一步，所述重链⑶R1-3的核苷酸序列为：
[0019]CDRl :如序列表中SEQIDNO :49 或SEQIDNO :55 所示；
[0020] CDR2 :如序列表中SEQIDNO :50 或SEQIDNO :56 所示；
[0021] CDR3 :如序列表中SEQIDNO :51 或SEQIDNO :57 所示。
[0022] 本发明的目的在于提供一种抗StxI的单克隆抗体8E7-E6,所述的单克隆抗体 8E7-E6的轻链蛋白质分子可变区的互补决定区⑶R1、⑶R2、⑶R3的氨基酸序列，分别如序 列表中SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3所示。所述单克隆抗体8E7-E6的重链蛋 白质分子可变区的互补决定区⑶R1XDR2、⑶R3的氨基酸序列分别如序列表中SEQIDNO: 4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6 所示。
[0023] 进一步，所述的单克隆抗体8E7-E6的轻链蛋白质分子可变区的互补决定区⑶R1、 CDR2、CDR3 的核苷酸序列，分别如序列表中SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48 所示。所述单克隆抗体8E7-E6的重链蛋白质分子可变区的互补决定区⑶R1XDR2、⑶R3的 核苷酸序列分别如序列表中SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51所示。
[0024] 所述单克隆抗体8E7-E6包括轻链和重链，其氨基酸可变区序列分别如序列表中 SEQIDN0:7、SEQIDN0:8所示，其编码基因分别如序列表中SEQIDN0:9、SEQIDN0:10 所示。
[0025] 本发明的目的在于提供一种抗StxI的单克隆抗体2F6-F8,所述的单克隆抗体 2F6-F8的轻链蛋白质分子可变区的互补决定区⑶R1、⑶R2、⑶R3的氨基酸序列，分别如序 列表中SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13所示。所述单克隆抗体2F6-F8的重 链蛋白质分子可变区的互补决定区⑶RlXDR2、⑶R3的氨基酸序列分别如序列表中SEQID NO: 14、SEQIDNO: 15、SEQIDNO: 16 所示。
[0026] 进一步，所述的单克隆抗体2F6-F8的轻链蛋白质分子可变区的互补决定区⑶R1、 CDR2、CDR3 的核苷酸序列，分别如序列表中SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54 所示。所述单克隆抗体2F6-F8的重链蛋白质分子可变区的互补决定区⑶R1XDR2、⑶R3的 核苷酸序列分别如序列表中SEQIDNO:55、SEQIDNO:56、SEQIDNO:57所示。
[0027] 所述单克隆抗体2F6-F8包括轻链和重链，其氨基酸可变区序列分别如序列表中 SEQIDNO:17、SEQIDNO:18所示，其编码基因分别如序列表中SEQIDNO:19、SEQIDNO: 20所示。
[0028] 本发明的目的在于提供一种检测I型志贺毒素的ELISA试剂盒，其特征在于，所 述试剂盒中的抗体或其片段轻链⑶R1-3的氨基酸序列选自SEQIDNO:1-3或11-13,重链 CDR1-3的氨基酸序列选自SEQIDNO:4-6或14-16。
[0029] 进一步，所述ELISA试剂盒为双抗夹心法ELISA试剂盒，所述包被抗体为8E7-E6 单克隆抗体，所述检测抗体为2F6-F8单克隆抗体。
[0030] 进一步，试剂盒还包括下列试剂中的一种或几种：辣根过氧化物酶底物缓冲液、蛋 白标准品Stxl、阴性对照样品、底物、BSA、PBS+0. 05%Tween20洗液、封闭液、终止液。
[0031] 本发明的目的在于提供上述单克隆抗体或其片段、ELISA试剂盒在制备检测I型 志贺毒素中的应用。
[0032] 本发明的目的在于提供上述的单克隆抗体或其片段在制备治疗I型志贺毒素所 引起疾病的药物中的应用。
[0033] 本发明的优点：本发明提供的抗体特异性靶标Stxl，所制备的双抗夹心ELISA试 剂盒仅识别I型志贺毒素，而不识别II型志贺毒素，具有很好的临床应用价值。
【附图说明】
[0034] 图1.从杂交瘤细胞中抽提的总RNA
[0035] 图2.MHV11/MHCG1引物组合扩增的条带
[0036]泳道 1 为Lanelvk;泳道 2 为lane2vh;泳道 3 为marker
[0037] 图3.MHV2/MHCG1引物组扩增的条带
[0038]泳道 1 为Lanelvk;泳道 2 为lane2vh