一类抗CD20-Flex双功能融合蛋白、其制备方法及用图
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一类抗CD20双功能融合蛋白、其制备方法及其在制备抗体肿瘤药物中的应用。本发明公开的抗CD20双功能融合蛋白，具有类似全抗体结构与功能的CD20-Flex双功能融合蛋白，既可以与CD20结合，又具有Flt3配体的功能。
【背景技术】
[0002]肿瘤尤其是恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病中所致死亡中居第二位。而且近年来，其发病率呈明显上升趋势。恶性肿瘤治疗效果差，晚期转移率高，预后多不佳。目前临床上所采用的常规治疗方法如放疗、化疗和手术治疗虽然在很大程度上缓解了病痛，延长了生存时间，但这些方法均存在很大的局限性，其疗效难以进一步提闻。
[0003]抗体靶向性药物具有特异性好、副作用小、半衰周期长等优点，现今已经广泛的应用于肿瘤的临床治疗。抗体药物在临床治疗中已经取得了令人鼓舞的治疗效果。但是，由于肿瘤发生、发展过程的异质性和复杂性，单个靶点的抗体靶向药物仅仅特异性的靶向一个目标蛋白来发挥杀伤、阻断等效应，很难更加有效的杀伤肿瘤细胞、激发机体免疫、克服肿瘤复发。因此，目前抗体研究领域主要集中在提高抗体的亲和力、发现新的抗体靶标以及制备多靶向抗体等方面。采用计算机辅助设计以及文库技术提高抗体亲和力的方法已经非常成熟，采用蛋白组学技术配合使用质谱检测技术发现新的药物靶标，也已经得以实现。现今的方法已经能够快速制备亲和力达到InM的抗体，新的药物靶标也在不断的进行临床前及临床试验中。然而，目前制备多价抗体的方法主要是将抗体可变区改造成单链抗体，这种方法获得的多价抗体普遍抗体亲和力不高，疗效也没有达到预期的效果。最近出现的DVD抗体是将两种抗体的重链可变区及轻链可变区分别对应进行融合，形成HVl-1inker-HV2以及LVl-linker-LV2的结构。这种DVD抗体虽然克服了单链抗体亲和力低的缺点，但是由于分子量过大、抗体结构变化较大，会导致其表达量不高；而且，当靶蛋白分子量较大或者在细胞膜上形成较大复合物时，会影响DVD抗体对双靶点的结合。
[0004]Rituximab (利妥昔单抗)商品名为美罗华，是一种抗⑶20的嵌合单克隆抗体，1997年由美国FDA批准用于治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，与CHOP联合应用可用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤等其他B细胞淋巴瘤。
[0005]虽然对抗体治疗肿瘤机理的不然深入研究，目前认为:抗体通过⑶C、ADCC以及诱导细胞死亡能够显著的杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤的增长，但是越来越多的证据表明抗体诱导的机体特异性免疫杀伤在克服肿瘤复发过程中发挥重要的作用。
[0006]Flt3配体胞外区(Flex)不仅能使骨髓增加生产DC的数量，而且可使DC的功能趋向成熟，使后者具有更强的抗原递呈和抗肿瘤作用，更重要的是，Flex还能够使成熟的DC从骨髓释放出来进入外周组织，体内实验证实应用Flex后，小鼠脾脏、骨髓、淋巴结、肝脏中DC呈时间依赖性增加。因此，制备一类在具有杀伤性同时能有效激发机体肿瘤特异性免疫的抗体，是目前抗体研究的一个热点。
[0007]
【发明内容】
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为了解决上述问题，本发明的发明人进行了长期研究，经大量试验，利用基因工程技术构建了一类具有类似全抗体结构与功能的CD20-Flex双功能融合蛋白，该双功能融合蛋白既可以与⑶20结合，又具有Flt3配体的功能。
[0008]本发明公开了:
1.一种具有类似全抗体结构与功能的CD20-Flex双功能融合蛋白，其特征是，既可以与⑶20抗原结合，又具有Flt3配体的功能。
[0009]2.上述的双功能融合蛋白，由三条肽链构成，分别为Flex-CL-Hinge-CH2_CH3(SEQID NO: 18 ) rituximab 重链 knob 突变体(SEQ ID NO: 16 )rituximab 轻链(SEQ ID NO:10 )。
[0010]3.一种分离的核苷酸分子，编码上述的三条肽链，具有SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:9所述核苷酸序列。
[0011]4.一种载体，含有上所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，其中载体可以为 pDRl, pcDNA3.1 ( + )，pcDNA3.1/ZE0 ( + )，pDHFR 之一。
[0012]5.上述载体，为 pcDNA3.1 ( + )或 pcDNA3.1/ZE0 ( + )。
[0013]6.一种宿主细胞，含有上述的载体，为真核细胞。
[0014]7.上述宿主细胞，为哺乳动物细胞。
[0015]8.上述宿主细胞，为CHO细胞。
[0016]9.一种制备上述⑶20-Flex双功能融合蛋白，该方法包括:
a)分别克隆0)20抗体rituximab可变区与Flt3配体膜外区；
b)在抗体Fe区域分别构建knob突变体:T366ff,S354C ；hole突变体:T366S, L368A,Y407V 和 Y394C ；
c)将Flt3配体膜外区与抗体轻链恒定区融合构建Flex-CL融合片断；
d)分别将rituximab重链可变区与knob突变体融合,Flex-CL与hole突变体融合,装入表达载体；
e)将构建好的两个表达载体与装有rituximab轻链基因的表达载体共同转染进行表达，分离纯化。
[0017]10.一种组合物，含有上述⑶20-Flex双功能融合蛋白，和药学上可接受的载体。
[0018]11.上述⑶20-Flex双功能融合蛋白在制备抗体肿瘤药物中的用途。
[0019]12.上述组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
[0020]13.上述任一用途，还包括和其他的抗肿瘤药物联合使用。
[0021]本发明的目的是提供一类具有类似全抗体结构与功能的CD20-Flex双功能融合蛋白，既可以与CD20结合，又具有Flt3配体的功能。该类抗体既保留了类似抗体的结构和大小，具有和亲本抗体类似的亲和力和半衰期，也保留了 CD20抗体杀伤肿瘤相似的CDC、ADCC和诱导细胞死亡的能力，又结合了 Flt3配体能够在肿瘤附近诱导DC和NK细胞的增殖和成熟，激发机体肿瘤特异性免疫，克服肿瘤的复发。
[0022]本发明对抗体结构进行了深入理解，在此基础上，建立了一种既保留类似抗体的结构与功能又具有Flt3配体功能的融合蛋白，其结构如图1所示。为了证明该方法具有比rituximab抗体与Flex-1g联合用药更好的疗效,本发明进行后续蛋白抗肿瘤作用的实验。原则上，本发明的方法能够广泛的应用于各种抗体与Flex构建双功能融合蛋白，加速研发具有生物学和医学意义的融合蛋白。同时，将抗体可变区与Flex相结合构建双功能融合蛋白的方法，为以后进行双功能融合蛋白的设计提供一种新的思路。
[0023]本发明中，任何合适的载体都可以使用，可以为pDRl，pcDNA3.l( + )，pcDNA3.1/ZE0( + )，pDHFR之一，表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。
[0024]哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统可用于本发明的双功能融合蛋白的表达，COS，CHO, NSO，sf9及sf21等细胞均可适用于本发明。
[0025]可用的宿主细胞为含有上述载体的原核细胞，可以为DH5a，BL21 (DE3)，TGl之一。
[0026]本发明中公开的具有抗体结构与功能优势的双功能融合蛋白的制备方法为在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达双功能融合蛋白，分离或纯化所述的双功能融合蛋白。
[0027]可以利用亲和层析的方法对本发明公开的双功能融合蛋白进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的双功能融合蛋白。
[0028]利用上述方法，可以将双功能融合蛋白纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。
[0029]根据本发明的一个优选实施例，一类双功能融合蛋白包含rituximab的抗原结合区及Flt3配体胞外区。
[0030]一类双功能融合蛋白具有抗体结构与功能优势，其制备方法包括以下步骤:
1)分别克隆rituximab抗体重链可变区和Flt3配体胞外区基因；
2)将Flt3配体胞外区的基因与抗体轻链恒定区进行融合，构建Flex-CL融合片段；
3)分别对抗体Fe区域构建knob突变体:T366W,S354C ；hole突变体:T366S，L368A,Y407V 和 Y394C ；
4)分别将rituximab重链可变区与knob突变体融合,Flex-CL与hole突变体融合,装入表达载体；
5)将上述表达载体与rituximab抗体轻链进行共转表达,通过分离纯化得到双功能融合蛋白。
[0031]将上述构建好的完整的重、轻链基因分别装入真核表达载体pcDNA3.1 ( + )(Invitrogen公司产品)。上述质粒一起用脂质体法转染CHO-Kl细胞(ATCC),并用含600 μ g/ml G418的选择培养基筛选稳定表达双功能融合蛋白的细胞克隆。利用Protein A层析柱，通过亲和层析从细胞培养物的上清中纯化得到双功能融合蛋白。
[0032]上述双功能融合蛋白或制剂在制备抗癌的药物中应用，还包括和其它的抗肿瘤药物联合使用。
[0033]本发明公开上述双功能融合蛋白，可以和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的双功能融合蛋白氨基酸核心序列的构像完整性，同时还要保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。通常情况下，对于液体制剂，通常可以在2° C-8° C条件下保存至少稳定一年，对于冻干制剂，在30° C至少六个月保持稳定。在这里制剂可为制药领