一种用于饲用屎肠球菌冻干制剂的保护剂及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，涉及一种用于饲用屎肠球菌真空冷冻干燥处理的保 护剂及冻干制剂的制备方法。
【背景技术】
[0002] 真空冷冻干燥是一种实现活性乳酸菌长期保藏的常用的、有效的方法。但是，在 冷冻干燥过程中，乳酸菌细胞会受到各种各样的损伤，主要包括冰晶体的形成，细胞膜受到 机械破坏，细胞膜渗透压的改变，胞内失水，溶质浓度升高，产生溶质效应，敏感蛋白变性和 失活，水分的损失影响到细胞内许多亲水性大分子物质的功能，此外，还会导致细胞内外PH 的动态平衡被破坏，甚至出现DNA的损伤，这些损伤必然造成冷冻干燥过程中细胞存活率 的损失。为了减少真空冷冻干燥处理对乳酸菌细胞造成的损失，提高冻干存活率，必须采取 各种有效的措施对乳酸菌加以保护。
[0003] 各种保护措施中，最有效的是使用冻干保护剂。通常来说，用于乳酸菌真空冷冻 干燥的保护剂主要分为3类：一、可以渗透进入细胞壁和细胞膜的保护剂，称为渗透保护剂 (例如一些单糖、二糖和甘油等）；二、只能渗透进入细胞壁，不能进入细胞膜的保护剂，也 可以称为半渗透保护剂（例如一些寡糖、氨基酸和低分子聚合物）；三、无法渗透进入细胞 壁，或者不能直接和细胞表面作用的保护剂（例如高分子聚合物和多糖等）。不同类型保 护剂对细胞产生的保护作用不尽相同：渗透保护剂可以增强细胞膜的可塑性，进入细胞质 后易与溶液中的水分发生水合作用，减少细胞过度脱水，降低溶质的毒性作用，减缓冰晶的 形成，从细胞内部实现保护作用；半渗透保护剂聚集于细胞膜和细胞壁之间，可以在冷冻前 诱导细胞的胞浆分离，而且能够在细胞膜和细胞壁之间形成缓冲带，阻止冰晶带来的机械 伤害，从而保护了细胞膜及内部的结构；非渗透保护剂无法进入细胞内部，只能吸附于细胞 表面，形成粘滞层，阻止冰晶的形成速度，从细胞外部实现保护作用。很多报道表明，上述3 类保护剂中任何一类保护剂的单独使用都很难实现理想的保护效果，只有将3类保护剂复 合使用才能实现理想的保护。除冻干保护剂外，菌悬液的预冻条件、菌泥与保护剂的混合比 例、冻干制剂的贮藏条件等因素也会影响到乳酸菌冻干过程的存活率。
[0004] 目前市售冻干乳酸菌制剂的活菌数大多在2X10n-5X10nCFU/g的范围，极少有 超过5X10 nCFU/g的水平，而且其中大部分产品属于人用产品，将真空冷冻干燥的方法用 于生产饲用乳酸菌活菌制剂的研宄和应用都比较少，原因主要是成本较高，冻干制剂的贮 藏条件较严格，而且目前该工艺主要用于乳酸杆菌，很少针对乳球菌开发出优良的冻干制 剂。因此，开发一种用于饲用乳球菌真空冷冻干燥处理的低成本、高产量、耐贮藏的冻干保 护剂和冻干工艺是十分有意义的。
【发明内容】
[0005] ( -）发明目的：
[0006] 本发明针对上述不足，提供了一种用于屎肠球菌（Enterococcus faecium)WEI-10 CGMCCNo. 7746真空冷冻干燥处理的保护剂和冻干制剂的制备方法，从而减少真空冷冻干 燥处理对屎肠球菌带来的损伤，获得低成本、高活菌数、耐IC藏的屎肠球菌（Enterococcus faecium)WEI-10 CGMCC No. 7746 冻干制剂。
[0007] (二）技术方案：
[0008] 本发明的目的通过如下方案获得实现：
[0009] 1.本发明提供了 一种用于屎肠球菌（Enterococcus faecium)WEI_10 CGMCC No. 7746真空冷冻干燥的保护剂，其成分及含量（质量百分比）如下：脱脂奶粉5-15%、山 梨醇1-3 %，甘氨酸0. 02-0. 2 %，低聚半乳糖0. 2-2 %，麦芽糖0. 2-2 %，其余成分为蒸馏水。 配制方法如下：称取50-150g脱脂奶粉，10-30g山梨醇，2-20g低聚半乳糖和2-20g麦芽糖 溶于蒸馏水中，定容至990mL，115°C灭菌20min ;称取2-20g甘氨酸溶于蒸馏水中，定容至 100mL，过滤除菌后，取IOmL加入到上述灭菌的保护剂溶液中，混合后待用（下同）。
[0010] 2.本发明提供的保护剂与菌泥的混合比例为：每克菌泥与3-5mL保护剂混合。
[0011] 3.本发明提供的屎肠球菌（Enterococcus faecium) WEI-10 CGMCC No. 7746 冻干 制剂的制备方法如下：
[0012] (1)高密度发酵后的屎肠球菌（Enterococcus faecium)WEI-10 CGMCC No. 7746经 管式离心机在10000-15000rpm条件下离心收集菌体。
[0013] (2)将保护剂与收集的菌泥混合后置于勾衆机中，2800rpm勾衆5min。
[0014] (3)采用以下任一预冻方式：其一、将匀浆液直接置于不锈钢托盘中（每盘中匀浆 液厚度不高于2厘米），将托盘于-80°C预冻4-6h ;其二、将匀浆液用5毫升枪头逐滴加入 盛有液氮的容器中，使之冷冻成为球状，待液氮完全挥发后，将冷冻的球状物转至不锈钢托 盘中。
[0015] (4)将托盘放入冻干机中进行真空冷冻干燥，冻干程序为：-40°C条件下3h，之后 每隔3h温度升高5°C，并在该温度下维持3h，直至温度升至25°C，在25°C条件下保持5h后 冻干结束。
[0016] (5)冻干后的固体菌粉经粉碎后装入样品袋，并于-20°C或常温贮藏。
[0017] (三）意义：
[0018] 本发明提供了 一 种用于屎肠球菌（Enterococcus faecium) WEI-10 CGMCC No. 7746真空冷冻干燥的保护剂及冻干制剂的制备方法。优选的保护剂中脱脂奶粉属于非 渗透保护剂，其中的乳蛋白可以在细胞表面形成保护壳，从而稳定细胞膜的组成，防止细胞 受到损害；山梨醇作为乳酸菌细胞冻干和贮藏的保护剂可以和细胞膜发生相互作用，阻止 膜受到伤害；与胞内蛋白形成复合物，稳定蛋白的结构和功能；山梨醇具有抗氧化性，可以 保护细胞脂类免受氧化；甘氨酸和低聚半乳糖属于半渗透保护剂，聚集于细胞膜和细胞壁 之间，可以在冷冻前诱导细胞的胞浆分离，而且能够在细胞膜和细胞壁之间形成缓冲带，阻 止冰晶带来的机械伤害，从而保护了细胞膜及内部的结构；麦芽糖具有多个羟基，这些羟基 可以与细胞膜上的磷酸连接形成氢键，阻止膜因失水而融合，同时降低相变温度，使细胞不 易发生凝胶相变；另外，糖类的羟基还可与胞内蛋白质形成氢键以取代干燥时失去的水分 子，保证大分子蛋白质失水后仍维持天然结构和功能。应用本发明提供的保护剂及冷冻干 燥工艺获得的屎肠球菌（Enterococcus faecium) WEI-10 CGMCC No. 7746冻干制剂存活率 最高达到98 %，活菌数最高达到8. 2 X 10nCFU/g，远远高于国内市场上屎肠球菌冻干制剂 的活菌数含量（5X 10nCFU/g)。此外，应用本发明获