农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种生物育种领域，尤其涉及一种农杆菌介导英白黑粉菌（ escWeflia )转化子菌株及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 茭白是我国特有的水生蔬菜，在我国的绝大部分省份均有种植，生产经济效益很 高。作为蔬菜的英白主要是受英白黑粉菌escwAwia)侵染而膨大为肉质莖。现 有研究表明，自然界中，植物芽变的频率是非常低的，而茭白可以在很小的群体内分离出较 多较大的稳定变异，因此，虽然目前对于黑粉菌侵染茭白的机理尚未完全阐明，但可以据此 推测茭白的变异主要不是来自茭白植株的芽变，而是来自茭白黑粉菌的遗传变异。
[0003] -般认为，黑粉菌是重要的植物病原菌，由黑粉菌引起的植物病害称为黑粉病。 危害玉米的黑粉病主要有丝孢堆黑粉菌和玉米黑粉菌（大麦坚黑粉菌 Aorofei)则引起大麦、燕麦、筱麦和青稞黑粉病。但是，英白黑粉菌则有所不同， 在茭白黑粉菌特异性地侵染茭白后，宿主以及真菌本身产生大量的植物激素(吲哚乙酸)， 使得茎部膨大长出可食用的瘤。因此，茭白黑粉菌的遗传调控是茭白育种的关键之一，由于 茭白黑粉菌便于实验室操作，一旦在遗传操作上有所突破，它必将是茭白育种中的一个新 的重要突破口，不仅为阐明茭白黑粉菌侵染机理提供技术支撑，从而有利于实现茭白黑粉 菌向茭白植株的成功接种，而且可以在此基础上通过黑粉菌的不同菌株和茭白的不同品种 植株进行接种组合，可获得所需要的茭白品种类型，从而建立更好的茭白育种平台。
[0004] 对于真菌中常用的转化方法有基于原生质体制备和再生的PEG-CaClJi、电转化 法、基因枪法、限制性内切酶介导整合（REMI)和农杆菌介导法(ATMT) 15PEG-CaCU法是目前 应用最为广泛的方法，可以将单个质粒转化原生质体，也可以两个质粒同时转化原生质体， 即共转化。但是原生质体制备和再生的过程复杂、重复性差，这就造成了 PEG-CaCl2法操作 繁琐、转化效率低。虽然电转化法、基因枪法可以用分生孢子作为受体，但是这类方法的转 化效率也很低。REMI是一种将线性化的质粒DNA随机插入到生物体基因组DNA中从而产生 插入突变的技术，但该技术产生的突变体有30%-50%不是插入突变引起的，假阳性高。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述的技术问题，本发明的一个目的是提供一种农杆菌介导茭白黑粉菌 转化子菌株，本发明的第二个目的是提供上述的茭白黑粉菌转化子菌株的制备方法，本发 明的第三个目的是提供上述的茭白黑粉菌转化子菌株的应用。
[0006] 为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案： 农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株，该转化子菌株的农杆菌感染受体为茭白黑粉菌 iUstilago esculenta、。
[0007] 作为优选，所述的农杆菌采用农杆菌菌株AGL-1，农杆菌菌株GV3101或农杆菌菌 株EHA105。最优选，农杆菌为农杆菌菌株EHA105。
[0008] 作为优选，所述的农杆菌的基因表达载体采用植物pCAMBIA1301表达载体，并用 来自构巢曲霉gpda(glyceraldehyde_3-phosphate dehydrogenase,三憐酸甘油醒脱氢酶 基因）启动子和hsp70 (heat-shock protein 70-encoding gene,热激蛋白基因）启动子 中的一种或两种替换植物表达载体中的35S启动子。或者，农杆菌的基因表达载体以pPK2 载体为骨架，通过Infusion的同源重组方法插入各种目的片段构建所需表达载体。目前直 接能用于真菌的载体很少，所以本发明通过改造植物PCAMBIA1301表达载体来进行茭白黑 粉菌的转基因。当然，采用现有的真菌表达载体也可以实现本发明的目的。
[0009] 作为优选，所述的植物PCAMBIA1301表达载体插入适用于真菌系统的SGFP报告基 因或新霉素磷酸转移酶II位点。为了便于后续表达的检测，本发明可以插入适用于真菌系 统的SGFP报告基因；另外，本发明的主要有潮霉素抗性基因 hyg，可以用潮霉素进行有效筛 选，以及新霉素磷酸转移酶II位点，可以用G418 (遗传霉素）进行筛选。
[0010] 为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案： 上述的农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株的一种制备方法，该方法包括以下的步骤： 1) 制备真菌表达载体； 2) 农杆菌感受态的制备； 3) 电转化农杆菌； 4) 农杆菌介导的转化获得所述的转化子。
[0011] 作为优选，上述的步骤1)包括以下的步骤： ① 将gpdA和hsp70启动子序列从现有其它基因载体中PCR扩增出来，在5'加上BstXI 位点，在3'加上ApaI位点，克隆至T载体； ② 将pCambial301载体上含AatII的片段PCR扩增出来，在5'加上ApaI位点，在3' 加上其他合适的T载体上有的酶切位点，然后克隆至T载体或直接酶切； ③ 将含有启动子的T载体用ApaI和KpnI酶切，将含有AatII片段的PCR产物或T载 体用ApaI和KpnI酶切，将这两者连接，得到含有启动子和AatII片段的质粒；用BstXI和 AatII将启动子和AatII片段切出，连接至用BstXI和AatII酶切过的pCambial301载体； ④ 接着要将多克隆位点的EcoRI和SacI位点之间插入真菌Hsp70启动子片段或gpda 启动子片段，在HindIII和PstI位点之间插入真菌的终止子trpc片段；在启动子hsp70和 pgpda的5'端加上EcoRI酶切位点，在3'端加上SacI酶切位点；在终止子Ttrpc的5'端 加上PstI酶切位点，Ttrpc的3'端加上HindIII酶切位点；将phsp70和pgpda启动子，两 端酶切位点EcoRI与SacI，扩增连接到pmdl9-T simple载体后用EcoRI与SacI双酶切，与 第一目标中的载体EcoRI与SacI双酶切片段连接后转化；新得到载体多克隆位点加入了真 菌启动子，将gpda启动子和hsp70启动子中的一种或两种，两端酶切位点HindIII与PstI， 扩增连接到pmdl9-T simple载体后用HindIII与PstI双酶切，与多克隆位点已经插入启 动子的载体HindIII与PstI双酶切后的片段连接后，最终转化得到包含真菌启动子并包含 潮霉素抗性位点的真菌表达载体。
[0012] 作为优选，上述的步骤2)包括以下的步骤： ① 将-80°C保存的甘油菌株在LB平板上划线，在28°C下过夜培养活化； ② 挑选平板上的单克隆，转入5ml的LB管中摇菌过夜； ③ 转移5ml小摇菌液至100ml LB的摇菌瓶中，28°C下250rpm振荡培养4-5小时，定 时测定菌液〇D_值，培养2小时后每30min测定一次，当OD _值达到0. 3-0. 4时，从摇床中 取出摇瓶，置于冰上充分冷却； ④ ）菌液转到预冷的50ml离心管中，4°C 4000g以下离心15分钟；小心地倒掉上清，用 20ml预冷的无菌水洗涤重悬菌体，此步骤有时可以重复一次； ⑤ 4°C 4000g以下离心20分钟后，用IOml预冷的10%甘油重悬浮菌体； ⑥ 4°C 4000g以下离心20分钟后，用2-3ml预冷的10%甘油重悬浮菌体； ⑦ 按100 μ 1等份装入预冷的I. 5ml离心管中，于-80°C保存。
[0013] 作为优选，上述的步骤3)包括以下的步骤： ① 于-80°C冰箱中取出电转化感受态细胞IOOul，冰浴化冻； ② 取2ul纯化好的载体质粒，载体质粒浓度为lOpg/ul，加入感受态细胞，冰浴5min，转 入预冷的电极杯中，2500V电击； ③ 加入500ul的LB培养基在28°C摇床中200rpm恢复培养2小时； ④ 4000g以下离心5分钟，在超净台内将离心管中500ul上清去掉，剩余菌液用枪头吹 打均匀，涂在LB平板上，L