一种丁酸梭菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种丁酸梭菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 1，3-丙二醇（1，3-propanediol，简写：1，3-PD)是一种重要的化工原料，作为一 种典型的二醇化合物，被广泛地应用于润滑剂、染料、油墨、防冻剂、溶剂和制药工业等行 业，还可合成聚氨酯等聚合物。1，3_丙二醇脱水和脱氢可以生产与四氢呋喃和γ-丁内酯 化学性质类似的产品，如氧杂环丁烷，并通过开环聚合反应生产类似于聚四亚甲基醚二醇 (PTMEG)的新型聚合物，或作为涂料中的反应溶剂。1，3-丙二醇和对苯二甲酸能够合成聚 对苯二甲酸丙二酯（PTT)，使得1，3-丙二醇倍受世人关注。PTT是继50年代聚对苯二甲酸 乙二醇酯（PET)、70年代聚对苯二甲酸丁二醇酯（PBT)之后实现工业规模的新的可成纤聚 酯高分子材料，是一种极有发展前途的新型聚酯材料。PTT与ΡΕΤ、ΡΒΤ相比除具有聚酯的耐 化学性外，还具有其它一些更优良的特性。如良好回弹性、抗污性、抗褶皱性，且易于染色、 手感柔软、富有弹性、易干、低静电性、生物降解性等特性，由于PTT的具有以上优良特性， 它在地毯工业、服装材料、工程热塑料以及其它众多领域有着很广泛的应用。
[0003] 现有技术中，1，3_丙二醇生产方法主要为化学合成法。化学法路线是化工原料经 过一系列化学催化反应最终合成1，3-丙二醇，该方法原料成本高、所用试剂容易造成环境 污染。生物法是指微生物，故成为现在1，3-丙二醇的主要生产方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种丁酸梭菌。
[0005] 本发明的另一目的在于提供上述丁酸梭菌的筛选方法。
[0006] 本发明的再一目的在于提供上述丁酸梭菌的应用。
[0007] 本发明的具体技术方案如下：
[0008] 一种丁酸梭菌（Clostridium butyricum)M01，于2014年9月1日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCN0. 9626,地址：北京市朝阳区北 辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所。
[0009] 上述丁酸梭菌MOl从土壤样品中筛选得到，具体的筛选方法包括如下步骤：
[0010] 取采集样品lg，加入到9mL梭菌增殖液体培养基中，37°C密封富集培养24h后 转入种子培养基，37°C厌氧选择性富集培养24h后进行高效液相色谱分析发酵产物，选取 能够生产1，3_丙二醇的阳性菌；于厌氧工作箱内，平板划线分离出单菌落，选取能够生产 1，3-丙二醇和培养特征、菌落形态均符合丁酸梭菌培养特征的菌株进行16SrDNA序列分析 鉴定；
[0011] 上述梭菌增殖液体培养基为：胰蛋白胨，l〇g/L ;牛肉膏，10g/L ;酵母粉，3g/L ;葡 萄糖，5g/L ;NaCl，3g/L ;NaAc，3g/L ;可溶性淀粉，lg/L ;半胱氨酸盐酸盐，0· 5g/L ;pH 7. 5 ;
[0012] 在本发明的一个优选实施方案中，所述种子培养基为：甘油，10?40g/L ; K2HPO4 · 3H20,2 ?5g/L ;KH2P04,1 ?3g/L ; (NH4)2S04,2 ?5g/L ;MgS04 · 7H20,2 ?5g/L ; CaCl2 ·2Η20, 2?5g/L ;酵母粉，I?lOg/L ;微量元素溶液，I?lOmL/L ;Fe溶液，I?IOmL/ L ;自然pH。
[0013] 进一步优选的，每升所述Fe溶液中含有FeSO4 · 7H201?IOg ;37% HCll?40mL。
[0014] 进一步优选的，每升所述微量元素溶液中包括：ZnCl2,0. 01?0. 2g ;MnCl2 · 4H20， 0· 01 ?0· 2g ;Η3Β03,0· 01 ?0· Ig ;CoC12 · 6Η20,0· 1 ?0· 5g ;CuC12 · 2Η20,0· 01 ?0· 05g ; NiCl2 · 6H20,0. 02 ?0. 05g ;Na2Mo04 · 2H20,0. 01 ?0. 06g ;37% HC1，1 ?9mL。
[0015] 一种应用上述丁酸梭菌MOl生产1，3-丙二醇的方法，包括如下步骤：
[0016] (1)种子培养：用无菌注射器取1?IOmL 丁酸梭菌MOl菌液接种于装有50? IOOmL种子培养基的血清瓶中，33?39°C、120?200rpm摇床培养8?16h，以获得一级种 子培养液；
[0017] ⑵种子扩大培养：用无菌注射器取1?IOmL种子液接种于装有50?IOOmL种子 培养基的血清瓶中，33?39°C、120?200rpm摇床培养2?8h，以获得二级种子培养液；
[0018] (3)发酵罐培养：在 33 ?39°C、100 ?250rpm(优选 150-250rpm)、氮气 0· 5 ? IOvvm条件下，将所述一级或二级种子培养液与发酵培养基以1:10?100的体积比进行发 酵罐培养，并使发酵液的PH保持为6. 5?7. 5 (优选向所述发酵液中流加浓度为1?15mol/ L的NaOH)，以生产所述1，3-丙二醇（可用高效液相色谱对所生产的1，3-丙二醇进行定性 和定量分析）。
[0019] 在本发明的一个优选实施方案中，所述种子培养基为：甘油，10?40g/L ; K2HPO4 · 3H20,2 ?5g/L ;KH2P04,1 ?3g/L ; (NH4)2S04,2 ?5g/L ;MgS04 · 7H20,2 ?5g/L ; CaCl2 ·2Η20, 2?5g/L ;酵母粉，I?lOg/L ;微量元素溶液，I?lOmL/L ;Fe溶液，I?IOmL/ L ;自然pH。
[0020] 在本发明的一个优选实施方案中，所述发酵培养基为：甘油30?500g/L; K2HPO4 · 3Η20,0· 1 ?2. Og ;ΚΗ2Ρ04,0· 1 ?2. Og ; (NH4)2S04,0. 5 ?5. Og ;MgS04 · 7Η20,0· 1 ? I. Og ;CaCl2 · 2Η20,0· 01 ?0· 2g ;酵母粉，0· 5 ?5. Og ;微量元素溶液，1 ?10mL/L ;Fe 溶液 1 ?10mL/L〇
[0021] 进一步优选的，每升所述Fe溶液中含有FeSO4 · 7H201?IOg ;37% HCll?40mL。
[0022] 进一步优选的，每升所述微量元素溶液中包括：ZnCl2,0. 01?0. 2g ;MnCl2 · 4H20， 0· 01 ?0· 2g ;Η3Β03,0· 01 ?0· Ig ;CoC12 · 6Η20,0· 1 ?0· 5g ;CuC12 · 2Η20,0· 01 ?0· 05g ; NiCl2 · 6H20,0. 02 ?0. 05g ;Na2Mo04 · 2H20,0. 01 ?0. 06g ;37% HC1，1 ?9mL。
[0023] 本发明的有益效果是：
[0024] I、本发明的丁酸梭菌易于培养，具有较高的1，3-丙二醇转化率和1，3-丙二醇生 产强度，而且对底物和产物具有较高的耐受性；
[0025] 2、本发明的方法通过丁酸梭菌利用可再生的原料甘油或者葡萄糖合成1，3-丙二 醇，相对化学法工艺路线，微生物发酵法具有原料可再生、污染小和成本低等优点。
[0026] 说明书附图
[0027] 图1为本发明实施例3中发酵罐培养阶段的发酵曲线，其中为甘油，□为 1，3-丙二醇，▲为乙酸，Λ为丁酸，〇为菌体干重；
[0028] 图2为本发明实施例4中发酵罐培养阶段的发酵曲线，其中为甘油，□为 1，3-丙二醇，▲为乙酸，Λ为丁酸，〇为菌体干重；
[0029] 图3为本发明实施例4获得的1，3-丙二醇的高效液相色谱分析结果。
【具体实施方式】
[0030] 以下通过【具体实施方式】结合附图本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
[0031] 实施例1
[0032] 1、菌种的分离和纯化
[0033] (1)取采集样品lg，加入到9mL梭菌增殖液体培养基中，37°C密封富集培养24h ;
[0034] (2)转入种子培养基，37°C厌氧选择性富集培养24h后进行高效液相色谱分析发 酵产物，选取能够生产1，3-丙二醇的阳性菌；
[0035] (3)于厌氧工作箱内，平板划线分离出单菌落，选取能够生产1，3_丙二醇和培养 特征、菌落形态均符合丁酸梭菌培养特征的菌株进行16SrDNA序列分析鉴定，最终获得一 株能够生产1，3-丙二醇的丁酸梭菌MOl ;
[0036] 上述梭菌增殖液体培养基为：胰蛋白胨，10g/L ;牛肉膏，10g/L ;酵母粉，3g/L ;葡 萄糖，5g/L ;NaCl，3g/L ;NaAc，3g/L ;可溶性淀粉，lg/L ;半胱氨酸盐酸盐，0· 5g/L ;pH 7. 5 ; 上述种子培养基为：甘油，10 ?40g/L ;K2HP04 ·3Η20, 2 ?5g/L ;KH2P04,1 ?3g/L ; (NH4)2SO4, 2 ?5g/L ;MgS04 · 7H20, 2 ?5g/L ;CaCl2 · 2H20, 2 ?5g/L ;酵母粉，I ?lOg/L ;微量元素溶 液，1?10mL/L ;Fe溶液，1?10mL/L ;自然pH。每升所述Fe溶液中含有FeSO4 · 7H201? IOg ;37% HCll?40mL。每升所述微量元素溶液中包括：ZnCl2,0. 01?0· 2g ;MnCl2 ·4Η20， 0· 01 ?0· 2g ;Η3Β03,0· 01 ?0· Ig ;CoC12 · 6Η20,0· 1 ?0· 5g ;CuC12 · 2Η20,0· 01 ?0· 05g ; NiCl2 · 6H20,0. 02 ?0. 05g ;Na2Mo04 · 2H20,0. 01 ?0. 06g ;37% HC1，1 ?9mL。
[0037] 2、菌种鉴定，将上述丁酸梭菌MOl进行形态特征和16S rDNA序列鉴定，具体过程 如下：
[0038] 所筛选菌株MOl菌体两端钝圆，中间部分轻度膨胀，菌体呈直杆状或稍有弯曲，单 个或成对，短链，有丝状菌体，带鞭毛，为革兰氏阳性杆菌。在琼脂平板上形成白色或奶油色 的不规则圆形菌落，稍突，直径为1?3mm，发酵过程中产1，3-丙二醇、产酸、产气。根据《伯 杰细菌鉴定手册》，判断所筛选出的菌株的形态学复合丁酸梭菌的特性，初步判断为丁酸梭 菌；
[0039] 所述菌株MOl的16S rDNA核苷酸序列如附录中序列表的SEQ ID 01所示，其与丁 酸梭菌的16S rDNA同源性可达99% ;
[0040] 基于以上特征将筛选得到的菌株MOl鉴定为丁酸梭菌（Clostridium butyricum)〇
[0041] 实施例2
[0042] 应用实施例1获得的丁酸梭菌MOl生产1，3-丙二醇的方法，包括如下步骤：
[0043] (1)种子培养：用无菌注射器取1?IOmL 丁酸梭菌MOl菌液接种于装有50? IOOmL种子培养基的血清瓶中，33?39°C、120?200rpm摇床培养8?16h，以获得一级种 子培养液；
[0044] ⑵种子扩大培养：用无菌注射器取1?IOmL种子液接种于装有50?IOOmL种子