一种具有降解偶氮化合物活性的地衣芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及有机固体废弃物处理领域，具体地说，涉及一种具有降解偶氮化合物 活性的地衣芽孢杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 城乡有机固体废弃物中特别是印染行业的废弃物常含有某些偶氮化合物，采用目 前的工艺很难去除。利用微生物处理含偶氮有机废弃物是易操作低成本的方法，从而引起 人们的广泛关注。采用微生物处理含有有害有机化合物污染的污泥，使其减量化、无害化和 资源化。
[0003] 地衣芽孢杆菌（Bacillus Iicheniformis)是一种常见的土壤微生物类群，能分泌 多种酶并运用于生化反应过程中。将具有偶氮还原酶活性及果胶酶等多种耐高温生物质水 解酶的地衣芽孢杆菌运用于相关污泥的减量化和无害化处理具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种具有降解偶氮化合物 活性的地衣芽孢杆菌及其应用。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明首先提供一种具有降解偶氮化合物活性的地衣芽孢 杆菌菌株UTM115,所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简 称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所，邮政编码： 100101)，保藏日期为2014年9月18日，保藏编号为CGMCC No. 9680。
[0006] 所述菌株UTMl 15分离自云南腾冲温泉采集的底泥样本，利用驯化培养基（葡萄糖 3g、淀粉 2. 5g、蛋白胨 2g、牛肉膏 2g、硫脲 0· 04g、偶氮染料 0· lg、KH2P040. 05g、NH4Cl 0· 2g、 NaHCO3O. lg、MgSO4 · 7Η200· 06g、MnSO4 · 7H20 0· 006g、FeCl3 · 6H20 0· 003g、CaCl2 · 2H20 0. 006g、水1000ml)在40°C，经多代富集驯化、定向筛选得到。
[0007] 所述菌株UTM115为革兰氏阳性、细胞0. 8X (2. 0?3. 5) μπκ直杆状、单生、芽孢 椭圆型、近中生，孢囊膨大；在含葡萄糖蛋白胨琼脂培养基（葡萄糖l〇g、蛋白胨l〇g、酵母膏 5g、氯化钠5g、琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH7. 0)上菌落光滑正园、扁平微突、蛋壳黄色、生长 迅速，35?50°C培养24小时后菌落直径约3mm，最适生长温度40?70°C。硝酸盐还原阳 性、接触酶阳性、氧化酶阳性、VP实验阳性。
[0008] 本发明还提供了用于克隆所述菌株16S rRNA的引物：
[0009] F :5' -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3';
[0010] R :5' -GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'。
[0011] 利用上述引物经PCR扩增该菌株的16S rRNA序列（如SEQ ID No. 1所示），将获得 序列提交到EzTaxon数据库进行比对，结果显示UTM115菌株的16S rRNA序列与Bacillus Iicheniformis的相似性最高，为99. 7%，此序列是鉴定该菌株的主要特征依据。
[0012] 利用通用引物UP-1S:5'-GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CA-3'和UP-2Sr:5'-AGC AGG GTA CGG ATG TGC GAG CC-3'经 PCR 扩增该菌株的 gyrB 基因序列（如 SEQ ID No. 2 所 示），将获得的序列提交到NCBI GeneBank数据库运用Blast程序进行序列比对，结果显示 UTM115菌株的gyrB基因序列与Bacillus Iicheniformis相似性最高，结合所述菌株的细 胞形态及生理生化特性为鉴定该菌株的次要特征。确定该菌株为地衣芽孢杆菌Bacillus Iicheniformis 0
[0013] 进一步地，所述菌株具有偶氮还原酶、果胶酶和β -(1，4)_木糖苷酶活性。偶氮还 原酶、果胶酶和β-(1，4)-木糖苷酶的编码基因分别如SEQ ID No. 3?SEQ ID No. 5所示。
[0014] 本发明还提供了含有述菌株的菌剂。
[0015] 进一步地所述菌剂的制备方法为：
[0016] 1)将所述菌株接种于培养基中，进行发酵培养，得到发酵液；
[0017] 2)将发酵液直接分装成为液体菌剂，或将发酵液经脱水干燥得到菌粉剂。
[0018] 更进一步地，所述步骤1)具体为：
[0019] (1)将所述菌株接种于培养基中，35-45°C温度下，100?250转/分钟摇瓶培养 1?2天得到摇瓶种子液；
[0020] (2)将摇瓶种子液按0. 01?1 %接种量接种至含有LB液体培养基的种子罐中培 养；培养温度35?45°C、通气量为1 2?0. 5 (v/v)、转速100?400转/分钟，培养时间 1?2天，得到种子罐种子液。
[0021] (3)将上述种子液按0. 1?1 %接种量接种至含有LB液体培养基的发酵罐中进行 培养；培养温度35?45°C、通气量为1 :0. 3?0. 6 (v/v)、转速60-200转/分钟，培养时间 1?2天，当OD6tltlS 2时停止培养，得到发酵液。
[0022] 作为优选，所述培养基为含葡萄糖蛋白胨的液体培养基，包括：葡萄糖5g、蛋白胨 15g、酵母膏5g、氯化钠5g、蒸馏水1000ml，pH为7. 0。
[0023] 本发明还进一步提供了所述菌株或所述菌剂在处理含偶氮化合物的有机固体废 弃物中的应用。
[0024] 其中，所述有机固体废弃物包括城市生活污水厂的下水污泥、生活垃圾、餐厨垃 圾、动物尸体或畜禽粪便，碳氮比为10?50:1、含水量为45%?65%。
[0025] 进一步地，所述应用具体为：
[0026] 1)将相当于总物料湿重0. 01%?1%的菌剂接种于有机固体废弃物中，混合均匀 进行堆肥好氧发酵；
[0027] 2)好氧堆肥发酵12?20天，其间保持通气，保持氧气含量为8?15%，间隔4? 5天翻堆1次；
[0028] 3)当含水量低于40%，同时温度不再升高时停止通气，发酵终止，堆体中的有机 物减量约85%，容积减量约60%，原物料中的偶氮化合物降低；
[0029] 4)剩余物料或焚烧或填埋或过筛分装成生物肥料。
[0030] 本发明的有益效果在于：
[0031] 本发明菌株UTM115可以用于有机固体废弃物生物的降解，特别是用于含偶氮化 合物的有机固废的处理，对治理城乡有机固体废弃物的污染有益。
【附图说明】
[0032] 图1为本发明所述UTMl 15菌株的系统进化树。
[0033] 图2为本发明所述UTMl 15菌株的显微镜照片。
[0034] 图3为好氧堆肥发酵用的发酵槽。
【具体实施方式】
[0035] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0036] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0037] 实施例1地衣芽孢杆菌UTMl 15的分离与鉴定
[0038] 取约1克温泉底泥样品置于装有多粒玻璃珠及50ml无菌水的250ml三角瓶中。 40°C、恒温摇床上震荡1小时，然后静置30分钟。在无菌条件下吸取上清液lml，接至装有 50ml已灭菌的富集培养基（葡萄糖2. 5g、淀粉2. 5g、蛋白胨2g、牛肉膏2g、硫脲0. 4g、偶氮 染料 0· lg、KH2PO4O. 05g、NH4Cl 0· 2g、NaHCO3O. lg、MgSO4 · 7H20 0· 6g、MnSO4 · 7H20 0· 006g、 FeCl3 · 6H20 0· 003g、CaCl2 · 2H20 0· 006g、水 1000ml)中，40°C震荡培养 3 天，转速 220 转 /分钟。取培养3天的菌液lml，加入到装9ml无菌水的试管中，以梯度稀释法配制成ΚΓ1， 10_ 2,10_3,10_4,10_5,10_6,10_ 7的稀释度，分别取0· Iml涂布于含偶氮化合物作为唯一碳源 的选择培养基平板上（Na2HP044. 5g、ΚΗ2Ρ042· 5g、MnSO4 · 7H20 0· 003g、FeSO4 · 7H20 0· 02g、 MgSO4 ·7Η20 0· 3g、CaCl20. 05g、NH4Cl 0· 5g、0. OOlg 偶氮化合物、琼脂 15g，蒸馏水 1000ml)。 40 °C培养4?5天后，挑取较大的单菌落进行纯化。
[0039] 以本发明菌株的DNA为模板，PCR扩增其16S rRNA基因序列，引物为（27f): 5， -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'和（1492r) :5， -GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'。 PCR反应程序为：95°C预变性5分钟，95 °C变性30秒，53 °C退火45秒，72 °C延伸90秒，30 个循环，72°C延伸10分钟。扩增产物经电泳检测其纯度后测序，测序结果见序列表SEQ ID No: 1 所不。获得的 16S rRNA基因序列通过EzTaxon数据库（http://www. ezbiocloud. net/) 进行比对，与菌株Bacillus Iicheniformis的相似性最高，同源性为99. 7%。如图1所示 的基于UTMl 15菌株及其相关菌株的16S rRNA基因序列，利用Mega5. 0系统进化软件构建 的系统进化树（最大似然法），说明其系统进化关系与地衣芽孢杆菌最近。利用通用引物 UP-IS:5'-GAA GTC ATC ATG ACC GTT CTG CA-3'和 UP-2Sr:5'-AGC AGG GTA CGG ATG TGC GAG CC-3'经PCR扩增该菌株的gyrB基因，测序结果见序列表SEQ ID No:2获得的序列提 交到NCBI GeneBank数据库运用Blast程序进行序列比对，结果显示UTMl 15菌株的gyrB 基因序列与Bacillus Iicheniformis相似性最高，结合菌株的形态学特征（如图2所示的 UTM115细胞的显微形态）及生理生化特征，把该菌株鉴定为Bacillus licheniformis，命 名为UTM115,并于2014年9月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所，邮编100101)。分 类命名为 Bacillus licheniformis，保藏号为