一种用病毒样颗粒包被量子点的方法

文档序号:8246722阅读:734来源:国知局
一种用病毒样颗粒包被量子点的方法【
技术领域
】[0001]本发明涉及一种示踪物质的制备方法,确切讲本发明涉及一种用病毒样颗粒包被量子点的方法,以及用这种方法制备的物质及应用。【
背景技术
】[0002]病毒样颗粒(Virus-likeParticles,VLPs),也称为核心样颗粒(Core-likeParticles,CLPs),是由病毒的结构蛋白组装而成的介于15nm?400nm的空心颗粒。VLPs不含病毒基因组,不能自主复制,在形态上与真正病毒粒子相似,可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞,有效诱导机体产生免疫保护反应。病毒的衣壳蛋白一般具有天然的自我装配能力,这为病毒的基础研宄及疫苗的开发提供了便利条件。其中一些VLPs允许外源抗原基因的插入或融合,产生在表面展示外源表位的嵌合病毒样粒子(cVLPs),或是通过化学方法将包括非蛋白类抗原在内的抗原偶联至粒子表面。多数VLPs具有包裹核酸或其它小分子的能力,可以用作基因或药物的运载工具。至今,已构建成功多种人类和动物病毒的VLPs。这些病毒粒子包装形成也各不相同,有的仅需要单一衣壳蛋白、多个衣壳蛋白,有的还需要病毒脂质囊膜。病毒样粒子具有的独特结构、展示表位的能力和能有效刺激产生免疫反应为研宄预防多种疾病提供很好的方法。此外,VLPs也应用于研宄病毒包装过程、形态以及病毒的体系结构。参见:Rodriguez-Limas,IA.,K.SekarandK.E.Tyo,Virus-likeparticles:thefutureofmicrobialfactoriesandcell-freesystemsasplatformsforvaccinedevelopment.CurrOpinB1technolj2013.24(6):p.1089-93.量子点(quantumdots,简称QDs)又可称为半导体纳米微晶体(semiconductornanocrystal),是一种由I1-VI族和II1-V族元素组成的纳米颗粒。目前研宄较多的主要是I1-VI型量子点即由第二副族和第六主族元素组成的量子点,如CdS、CdSe、CdTe等。主要应用在光学、生物诊断和传感器等领域。由于量子点的吸收光谱宽而连续,而发射光谱则窄而对称,所以可以通过调节量子点的组成和大小达到光学性质可调性,同时光学稳定性明显优于传统的有机染料。此外,量子点表面的电子,空穴复合过程对许多外部作用非常敏感,据此可建立荧光传感系统。如何制备量子产率高、性能稳定和具有特殊功能基团的量子点一直是研宄者追求的目标。目前,量子点的制备主要分为金属有机合成和水相合成两类方法。但是,由于量子点合成方法的限制以及材料自身的缺陷,使其在应用领域很受限制,所以如何将量子点合理化修饰成为近期研宄的热点。为了改善量子点的单分散、水溶性以及发光稳定性,研宄者做了大量的努力。聚合物材料因为在电磁光谱的可见光区对量子点的光学性质没有影响,所以成为量子点修饰的合适试剂。目前关于聚合物直接修饰量子点表面的研宄主要集中在生物学和光电子组装方面,修饰后的量子点稳定性大大提高。通常聚合物包覆的量子点比有机小配体包覆的量子点稳定性要强。此外,通过采用聚合物包覆的方法,可以获得各种各样功能性的量子点表面。量子点表面直接功能化的成功关键在于量子点在功能化后依然能保持发光性质。参见Luo,Y.H.,etal.,Cadmium-basedquantumdotinducedautophagyformat1nforcellsurvivalviaoxidativestress.ChemResToxicol,2013.26(5):p.662-73.人们已经在细胞成像,免疫分析,DNA杂交,生物传感器,共振能量转移等方面得到了较为成功的探索与尝试。在多数研宄中都涉及了量子点QDs与生物分子偶联的问题,这一步往往是进行深入研宄的基础。因此,只有对生物分子修饰QDs进行较为全面的研宄,才能更好地利用这一新型荧光物质。目前报道较多的量子点研宄主要有CdS,ZnS,CdSe,ZnTe、HgSe、CdS、CdTe、InAs、GaAs等。这些量子点具有激发光谱宽、可实现多种荧光光谱、较大的斯托克斯位移和较好的生物分析等特性.。但这些量子点从应用和环保角度来看,在获得生物相容性好、无毒性影响,荧光亮度高、稳定不变、水溶性好的性能方面还有不少问题有待解决。参见:Woolley,R.,etal.,Fromparticletoplatelet:optimizat1nofastable,highbrightnessfluorescentnanoparticlebasedcelldetect1nplatform.Nanomedicine,2013.9(4):p.540-9.[2]LiF,ZhangZP,PengJ,etal.1magingviralbehav1rinMammaliancellswithself-assembledcapsid-quantum-dothybridparticles[M].2009:718-726.。【
发明内容】[0003]本发明提供一种可克服现有技术不足,具有:生物相容性好、无毒性影响,荧光亮度高、稳定不变、水溶性好、用病毒样颗粒包被的量子点。[0004]本发明的用病毒样颗粒包被量子点的方法是用2-巯基乙酸或3-巯基丙酸作为CdSe/ZnS油溶性量子点的表面修饰剂,用犬细小病毒重组结构蛋白溶液与经修饰后的CdSe/ZnS油溶性量子点按体积比5:1_10:1加入透析袋内,再在其中按照5%的体积比加入浓度为2mg/mlSUMO蛋白酶,混匀后置pH=6.8的缓冲液透析,通过犬细小病毒重组结构蛋白的自组装特性将修饰后的量子点包装入病毒样颗粒内。[0005]本发明的用病毒样颗粒包被量子点的方法中使用的犬细小病毒重组结构蛋白是犬细小病毒重组结构蛋白VP2。[0006]本发明的用病毒样颗粒包被量子点的方法中,CdSe/ZnS油溶性量子点修饰方法为:将275μI的商品化的CdSe/ZnS正己烷溶液,加入到Iml的无水乙醇中,超声处理后,离心弃上清后加入300μI氯仿进行溶解,然后加入Iml的2-巯基乙酸(MAA)或3-巯基丙酸(MPA)混匀,室温下剧烈震荡lh,再经离心处理弃上清,将沉淀用氯仿洗涤,再用Iml硼酸盐溶液溶解沉淀。[0007]进一步,本发明的用病毒样颗粒包被量子点的方法,是将2mg/ml的犬细小病毒VP2蛋白溶液和修饰后的0.2mg/ml的量子点溶液按体积比5:1加入透析袋内,按犬细小病毒VP2蛋白溶液和修饰后的量子点溶液体积之和的100:1加入SUMO蛋白酶,混匀后放入缓冲液中进行酶切包装,得到目标病毒样颗粒包被量子点。试验中所用的缓冲液有PBS,TBS和HEPES缓冲液,pH值为6.6-7.8,其中:50mM/LTris-HCl,150mM/LNaClpH=6.8最好,可以在包装效率和生物相容性两方面达到最佳效果。[0008]采用前述的方法可以制备出包被量子点的病毒样颗粒。[0009]本发明的包被量子点的病毒样颗粒可在制备示踪剂方面的应用,也可在制备用于研宄病毒入侵机制的试剂中的应用。[0010]采用病毒样颗粒蛋白作为一种生物运载工具,这不仅解决了无机纳米材料量子点在生物应用中存在的无机相容性问题,同时通过在量子点外部包覆一层病毒衣壳蛋白的形式,来降低量子点的生物毒性作用。犬细小病毒能够选择性的侵染正常细胞,在侵染细胞的方式上具有特异性;由犬细小病毒的VP2蛋白组装成的VLP,具有与犬细小病毒相似的特性,VLP-QDs通过犬细小病毒侵入细胞的方式,利用宿主细胞转铁蛋白受体进入细胞,从而提高的QD进入细胞的靶向性。【附图说明】[0011]图1.琼脂糖凝胶电泳图,琼脂糖凝胶电泳检测修饰后表面电性,样品与甘油按I:I混合均匀加样,甘油起沉降样品的作用。其中:MPA-QD是用3-巯基丙酸修饰的CdSe/ZnS量子点;MAA-QD是用2-巯基乙酸修饰的CdSe/ZnS量子点;QD是CdSe/ZnS量子点,VLP是犬细小病毒样颗粒。[0012]图2.Zetasizer检测QD修饰前后的表面所带电荷数和电性。其中:MPA_QD是用3-巯基丙酸修饰的CdSe/ZnS量子点;MAA_QD是用2-巯基乙酸修饰的CdSe/ZnS量子点。[0013]图3.TEM透射电镜图片,其中㈧为CdSe/ZnS量子点的透射电镜图;(B)为MPA-CdSe/ZnS量子点的透射电镜;(C)为犬细小病毒样颗粒的透射电镜;(D)为犬细小病毒样颗粒包被的量子点的(VLP-QD)透射电镜图。[0014]图4.用Nanosizer检测不同比例的VP2蛋白与QD包覆后的粒径大小曲线。[0015]图5.用紫外连续光谱检测不同比例的VP2蛋白与QD包覆后的吸光率曲线。[0016]图6.MTT法检测MPA-QD和VLP-QD的细胞毒性曲线。其中:MPA_QD是用3-巯基丙酸修饰的Cd当前第1页1 2 
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