一种从血液中提取的抗氧化酶的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗氧化酶领域，具体涉及一种从血液中提取的抗氧化酶。
【背景技术】
[0002] 抗氧化酶是一类具有重要应用价值的生物酶。其可对抗与阻断因氧自由基对细胞 造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害，具有抗辐射、抗肿瘤 及延缓机体衰老等功能，在保健品、医药和化妆品行业中有重要的应用价值。
[0003] 目前，国内外抗氧化酶多数来源于动物血液、肝脏，现有技术对于从血液中提取抗 氧化酶多有报道。专利文献CN101338304A公开了一种从血液中提取超氧化物歧化酶的方 法，其步骤是：取动物红血球，低温溶血破碎获得溶血液，使用低温乙醇及三氯甲烷去除 溶血液中的血红蛋白，使用低温丙酮沉淀、离心获得低等级的超氧化物歧化酶混合物，使 用水浴加热再使用低温丙酮沉淀、离心收集超氧化物歧化酶混合物，使用磷酸盐缓冲液和 低温丙酮多次提纯获得超氧化物歧化酶。经比较和研宄可知，现有技术提供的从血液中提 取抗氧化酶的方法，需要经过长时间的组织破碎或超声破碎，对破碎匀浆物过夜静置，过程 耗时长，效率低；在去除血红蛋白和沉淀抗氧化酶步骤中，均需要使用有机溶剂，尤其在沉 淀抗氧化酶中，常需添加大量的丙酮，对环保提出了严峻的考验，并且丙酮在一定程度上还 会引起蛋白质活性丢失。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在克服现有技术存在的缺陷，提供一种从血液中提取的抗氧化酶，所述 抗氧化酶具有纯度高、抗氧化活性好的特点。
[0005] 本发明提供了一种从血液中提取的抗氧化酶，所述抗氧化酶由包括以下步骤的方 法制备而成：
[0006] 1)从血液中分离血红细胞，将洗净后的血红细胞与水混合，破碎血红细胞得提取 液，在所得提取液中加入氯仿和95%乙醇混合溶剂萃取，取上层溶液；将硫酸铵加入上层 溶液中，静置，离心后收集沉淀；
[0007] 2)将步骤1)所得沉淀溶解于pH7. 3?7. 5的0. 01?0. 02mol/L磷酸盐缓冲液 中，将所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝胶柱Sephadex G-25顶端，用本步骤所述磷酸盐缓冲 液进行洗脱，收集含有蛋白质且不含硫酸铵的洗脱液，浓缩，备用；
[0008] 3)在步骤2)所得产物中加入NaCl，使NaCl的终浓度为0. 4?0. 6mol/L，将所得 溶液加入平衡好的金属螯合亲和柱顶端，用pH值4. 1?4. 9的0. 015?0. 025mol/L柠檬 酸缓冲液进行洗脱，收集含有蛋白质的洗脱液；至洗脱液中检测不到蛋白质时，停止收集；
[0009] 4)取步骤3)所得洗脱液，浓缩，冷冻干燥，即得抗氧化酶。
[0010] 本发明所述步骤1)中，所述血液为哺乳动物的血液，从血液中分离血红细胞的方 法为生物领域常规方法；分离得到的血红细胞与水的体积比优选为1:0. 5?2 ;破碎血红细 胞使用的装置优选为闪式提取器，所述闪式提取器为本领域用于提取的常规闪式提取器， 也可以由本领域其它可以实现本发明所述提取效果的仪器或方法代替，其操作参数为：在 3000?8000rpm条件下提取，每次提取20?45s，共提取2?5次，每次间隔1?2min，提 取参数优选为在5000rpm条件下提取、每次提取30s、共提取3次、每次间隔2min;所述氯仿 体积优选为血红细胞体积的〇. 1?〇. 2倍，95%乙醇体积优选为血红细胞体积的0. 1?0. 3 倍；所述萃取具体为：在500?700rpm条件下搅拌5?15min，优选为在600rpm条件下搅拌 lOmin，再在3000?3200rpm条件下离心5?15min，优选为在3000rpm条件下离心15min。
[0011] 本发明所述步骤1)所述硫酸铵沉淀，应将上层溶液中的酶充分沉淀下来，可以沉 淀一次，优选为两次；当采用两次沉淀法时，包括以下步骤：将硫酸铵以质量体积比0. 3? 0.5:1溶解于上层溶液中，此处硫酸铵的质量单位为g，上层溶液的体积单位为ml，静置 20?40min，在0?4°C、7500?8500rpm条件下离心10?20min，分离上清液，收集沉淀； 在所得上清液中以质量体积比〇. 7?0. 9:1加入硫酸铵，此处硫酸铵的质量单位为g，上清 液的体积单位为ml，静置20?40min，在0?4°C、8500?9500rpm条件下离心25?35min， 收集沉淀；将两次收集所得的沉淀合并。
[0012] 在进行硫酸铵沉淀后，本发明选择凝胶层析法去除硫酸铵，从而实现酶的纯化。具 体而言，本发明步骤2)中，凝胶层析采用的磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲 液；缓冲液的浓度优选为〇. 〇15mol/L，pH值优选为6. 8 ;步骤3)所得沉淀以质量体积比 1:1?5溶解于磷酸盐缓冲液中，此处沉淀的质量单位为g，磷酸盐缓冲液体积的单位为ml ; 葡聚糖凝胶柱选用Sephadex G-25,凝胶柱的平衡和流动相的洗脱均为常规操作；所述浓缩 优选为聚乙二醇浓缩法，所述聚乙二醇优选为PEG4000,浓缩步骤为常规操作。采用凝胶层 析法能快速获得不含硫酸铵的蛋白溶液，避免了常规透析除盐方法的繁冗过程和可能造成 的目标产物损失。为了检验酶溶液中的硫酸铵是否被彻底除去，本发明采用比色法鉴定洗 脱液中的硫酸铵，具体步骤如下：取洗脱液，滴在白色比色盘孔中，加入等体积的奈氏试剂 混合，若出现棕黄色沉淀则表明洗脱液中含有硫酸铵。若收集的目标洗脱液进行该检测后， 不出现棕黄色沉淀，则硫酸铵去除完毕。
[0013] 本发明所述步骤2)和步骤3)均采用比色法鉴定洗脱液中的蛋白质，具体步骤如 下：取洗脱液，滴在黑色比色磁盘中，加入等体积的20%磺基水杨酸混合，若出现白色絮状 沉淀则表明洗脱液中含有蛋白质。步骤3)收集的目标洗脱液进行该检测后，应出现白色絮 状沉淀。
[0014] 本发明所述步骤3)采用金属螯合亲和柱对酶进行进一步的纯化，该步骤通过金 属亲和层析法进行蛋白纯化，能够快速获得纯化后的抗氧化酶，能够避免抗氧化酶的活性 损失，且安全性更高，更环保。具体而言，所述金属螯合亲和柱所螯合的金属离子选自铜、 锌、铁、镍离子等常规的螯合用金属离子；柠檬酸缓冲液的浓度优选为〇. 〇2mol/L，pH值优 选为4. 5 ;所述浓缩优选为聚乙二醇浓缩法，所述聚乙二醇优选为PEG4000,浓缩步骤为常 规操作。
[0015] 作为本发明的最优选方案，所述抗氧化酶由包括以下步骤的方法制备而成：
[0016] 1)从血液中分离出血红细胞，将洗净后的血红细胞与水以体积比1:1混合，用闪 式提取器破碎血红细胞，其操作参数为：在5000rpm条件下提取，每次提取30s，共提取3 次，每次间隔2min ;在所得提取液中加入血红细胞体积0. 1?0. 2倍的氯仿和血红细胞体 积0. 1?0. 3倍的95%乙醇组成的混合溶剂，在600rpm条件下搅拌lOmin，再在3000rpm条 件下离心15min，取上层溶液；将硫酸铵以质量体积比0. 4 :1溶解于步骤1)所得粗酶液中， 静置30min，在0°C、8000rpm条件下离心15min，分离上清液，收集沉淀；将硫酸按以质量体 积比0. 8:1加入所得上清液中，静置30min，在0°C、9000rpm条件下离心30min，收集沉淀； 将两次收集所得的沉淀合并；
[0017] 2)将步骤1)所得沉淀以质量体积比1 :5溶解于pH7. 4的0. 015mol/L磷酸二氢 钾-磷酸氢二钾缓冲液中，将所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝胶柱Sephadex G-25顶端， 用本步骤所述磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集含有蛋白质且不含硫酸铵的洗脱液，用PEG4000 浓缩，得浓缩液；
[0018] 3)在步骤2)所得浓缩液中加入NaCl，得到NaCl浓度为0. 5mol/L的溶液，将所得 溶液加入平衡好的镍离子螯合亲和柱顶端，用pH4. 5、0. 02mol/L柠檬酸缓冲液进行洗脱， 收集含有蛋白质的洗脱液；至溶液中不含有蛋白质时，停止收