一种提高自身产物抗性的选育方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物发酵技术领域，特别是涉及一种离子束诱变红色糖多胞菌提高自身产物抗性的选育方法。
【背景技术】
[0002]影响红霉素发酵生产的主要因素为菌种的质量。如何提高菌种的生产性状，是研究人员比较关注的问题。菌种的强弱直接影响到发酵效价。因此选育出一种优质菌种对于红霉素发酵来说具有非常重要的意义。
[0003]国内外的实践与理论均揭示出红霉素产生菌红色糖多胞菌的抗性基因与红霉素合成的结构基因和调控基因紧密连锁而易发生共突变。因此可采用不同诱变剂进行诱变处理，使诱变孢子的DNA或质粒产生高频率突变，然后将突变的孢子涂布于含不同药物致死浓度的培养基上进行抗药性突变株的检测和筛选。鉴于这一理论基础，我们得到一种离子束诱变红色糖多胞菌提高自身产物抗性的选育方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的就在于利用红色糖多孢菌菌丝生长产素的生理生化特点，结合离子注入诱变方法发明一种提高红色糖多孢菌自身产物抗性的选育方法，快速有效的获得抗性菌株，并将菌株稳定纯化，用于生产，提高生产发酵水平。
[0005]本发明具体技术方案为:
(I)制备不同梯度的抗性平板，从而确定红色糖多孢菌的致死浓度。将制备好的初始菌株孢子溶液涂布在含不同浓度红霉素的培养基平板上，适温培养4?6天，观察不同梯度平板上的菌落数，并记录不同浓度菌落形态。凡是在前一个低浓度平板上已长出菌落而在后一个较高浓度平板上未长出菌落的，后一浓度即为该菌种对红霉素的致死浓度。可以选用比致死浓度低的浓度制备分离平板，实验结果统计红霉素的致死浓度在5800?6000U/ml单位。根据致死浓度制备不同梯度的抗性平板，抗性药物红霉素的加量按照有效单位效价折算称量，溶解过滤除菌后加入不同的培养基内制备梯度平板。
[0006](2)离子束诱变注入。挑选生产使用的生长饱满的工作细胞库斜面，加入30ml无菌水，用接种环刮取孢子，将其悬浮在无菌水中，制成混合均匀的孢子悬浮液。用灭菌的滤纸进行过滤，收集过滤单孢子液，将孢子悬浮液稀释为合适的浓度，吸取一定量的孢子稀释液置灭菌的培养皿内，涂布均匀制备成单层菌膜，根据设定的诱变剂量进行诱变注入。
[0007](3)分离培养。将诱变注入处理过的悬浮液按不同剃度分离在抗性培养平板上培养。当平板培养约5?7天后终止培养，从生长出的菌落中挑选形态较好且有变化的单菌落进行斜面接种，放置在恒温室内培养，培养成熟后冷藏保存。
[0008](4)摇瓶考察。将保存的初筛斜面进行摇瓶考察，用接种环刮取一定量的孢子接种于种子瓶培养基内振摇培养。将生长成熟的摇瓶种子培养液移种到发酵摇瓶培养基内进行发酵培养，检测发酵摇瓶效价单位。挑选效价单位高于对照10%的菌株进行初筛留种保存。将保存的初筛留种株进行复活增殖进行复筛考察。
[0009]本发明采用离子束诱变红色糖多胞菌提高自身产物抗性，解决红霉素后期菌丝自溶，活力降低的现状，提高放罐单位和生产效益。
【具体实施方式】
[0010]1、制备抗性平板，确定致死浓度。将制备好的初始菌株孢子溶液涂布在含不同浓度红霉素的培养基平板上，适温培养4?6天，观察不同梯度平板上的菌落数，并记录不同浓度菌落形态。凡是在前一个低浓度平板上已长出菌落而在后一个较高浓度平板上未长出菌落的，后一浓度即为抗性药物红霉素对红色糖多胞菌的致死浓度。可以选用比致死浓度低的浓度制备分离平板，实验结果统计红霉素的致死浓度在6000U/ml单位左右，超过6000单位生产菌将不能在培养平板上生长。根据致死浓度制备不同梯度的抗性平板，抗性药物红霉素的加量按照有效单位效价折算称量，溶解过滤除菌后加入不同的培养基内制备梯度平板。
[0011]2、离子束注入诱变。挑选大生产使用的生长饱满的工作细胞库斜面，加入30ml无菌水，用接种环刮取孢子，将其悬浮在无菌水中，制成混合均匀的孢子悬浮液。用灭菌的滤纸进行过滤，收集过滤单孢子液备用。将制备的单孢子悬浮液计数计算浓度，按照使用浓度要求进行稀释，吸取一定浓度的稀释液放置在灭菌的培养皿内，用三角扒涂布均匀制成单层菌膜，按照设定的诱变剂量进行诱变注入。
[0012]3、菌落挑选。将诱变注入处理过的悬浮液按不同剃度分离在抗性培养平板上培养。仔细观察菌落的生长变化，培养约5-7天后菌落有明显的形态分化可终止培养，从分离平板内的菌落中挑选形态较好且有变化的单菌落进行斜面接种，将接种后的试管斜面放置在恒温室内37°C培养，培养成熟后冷藏保存备用。配制摇瓶种子培养基，进行摇瓶种子接种。刮取初筛斜面的孢子悬浮液接种到种子培养基内。将生长成熟的摇瓶种子培养液移种到发酵摇瓶培养基内进行发酵培养，检测发酵摇瓶效价单位。挑选效价单位高于对照10%的菌株进行初筛留种保存。将保存的初筛留种株进行复活增殖进行复筛考察。
[0013]通过该选育方法筛选获得2株目的菌株，提高率分别为16.89%、15.64%。将该菌株用于生产中，发酵单位明显提高，且有效的改善了发酵后期菌丝自溶活力降低的现状。
【主权项】
1.一种提高自身产物抗性的选育方法，其特征是:将红色糖多孢菌出发菌株制备的孢子悬浮液采用离子束注入诱变方法诱变后，通过在抗性平板上培养筛选得到提高自身产物抗性的红霉素菌株。
2.按照权利要求1所述的提高自身产物抗性的选育方法，其特征在于上述选育方法使用的抗性平板的的制备过程为:将制备好的初始菌株孢子溶液涂布在含不同浓度红霉素的培养基平板上，适温培养4?6天，观察不同梯度平板上的菌落数，并记录不同浓度菌落形态，确定红霉素菌种的致死浓度，最终确定红霉素的致死浓度在5800?6000U/ml单位。
3.按照权利要求1所述的提高自身产物抗性的选育方法，其特征在于所述离子注入诱变采用N离子气体注入实现。
4.按照权利要求1所述的提高自身产物抗性的选育方法，其特征在于离子注入诱变后，将诱变注入处理过的悬浮液按不同剃度分离在抗性培养平板上培养，从生长出的菌落中挑选形态较好且有变化的单菌落进行斜面接种、摇瓶培养，发酵培养，检测发酵效价，初筛留种和复筛考察。
【专利摘要】本发明涉及一种提高自身产物抗性的选育方法，其特征是：将生产用红色糖多孢菌出发菌株制备的孢子悬浮液采用氮离子注入诱变方法诱变，将诱变后的悬浮液按不同剃度分离在抗性培养平板上培养，从生长出的菌落中挑选形态有变化的菌落进行增值培养，通过摇瓶考察，进行初筛留种和复筛考察留种，筛选获得目的菌株。本发明采用离子束诱变红色糖多胞菌提高自身产物抗性，解决红霉素后期菌丝自溶，活力降低的现状，提高放罐单位、增加生产效益。
【IPC分类】C12R1-645, C12N15-01
【公开号】CN104560942
【申请号】CN201310474918
【发明人】郭惠芬, 孙瑞君
【申请人】宁夏启元药业有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月12日