瓠瓜抗枯萎病基因片段或基因标记及应用
【技术领域】
[0001] 本发明是利用抗病基因同源序列方法，克隆瓠瓜抗枯萎病基因片段或者将其转化 为分子标记等，主要涉及瓠瓜常规杂交育种，分子标记辅助育种，抗枯萎病基因的定位和分 子作图，抗枯萎病基因的克隆以及抗病基因的调控机理分析等方面，属于植物生物技术科 学领域。
【背景技术】
[0002] 瓠瓜是长江中下游重要的蔬菜作物之一。枯萎病是瓠瓜生产上最重要的病害。主 要症状表现为植株萎蔫、枯死。发病初期近地面主茎蔓呈褐色水浸状腐烂，变细或纵裂，并 逐渐干枯。在高湿条件下，根、茎蔓病部常有琥珀色胶状物流出，表面产生白色或粉红色霉 状物（即病菌的分生孢子）。折断茎蔓和主根时，能看到维管束内部变褐色，有别于瓠瓜 蔓枯病。受害植株最初表现为部分叶片中午萎蔫，早晚可恢复，随后逐渐扩展到全株，一般 10?15天后整株死亡。
[0003] 此病由真菌半知菌亚门尖镰孢菌葫芦专化型侵染引起。病菌以菌丝、厚垣孢子或 菌核在种子或土壤中的病残体上越冬，成为次年初侵染源。病菌可在土壤中存活5?6年。 病菌借雨水、灌溉水等传播，病菌从根部伤口、自然裂口或根毛细胞侵入，也可从茎基部的 裂口侵入，最后进入到维管束发育堵塞导管，造成叶片萎蔫。该病是一种土传病害，病菌喜 温暖潮湿的环境，发育适温在24?27°C，空气湿度超过90%容易发病，土壤温度15°C时，潜 育期约15天。连作地、土壤湿度大、地下害虫多的田块发病重，时晴时雨或连阴雨后聚晴， 病害易流行。瓠瓜枯萎病是一种土传真菌性病害，整个生育期均可发病，但以座瓜期为发病 高峰。地势低洼、排水不良、基肥不足、氮肥施用过多、多年连作等地块一般发病较重。枯萎 病严重影响了瓠瓜植株的正常的生长发育过程，给生产带来极大的经济损失。抗病基因的 利用及抗病育种是瓠瓜病害防治最有效的方法。
[0004] 二十世纪四十年代，Flor提出了经典的"基因对基因"理论学说，即植物和病原 菌体内各自存在一个显性基因，植物抗病基因或病菌无毒性（Avr)基因的缺失或改变都能 引起病害的产生。这个模型适用于大多数活体营养型病原菌，包括病毒、细菌、真菌和线虫 类。"基因对基因"抗病性一般是受体被作为模型：植物抗病蛋白能够直接或间接的识别源 自病菌的Avr产物。一旦这种识别发生，就会引起防御反应。大多数抗病基因 （Resistance gene ;R)触发的抗性与快速防御反应相关，称为过敏性反应（hypersensitive response ; HR)。而目前，大多数抗病基因的产物都含有蛋白识别的结构域，如富含亮氨酸的重复单位 (LRR)的结构域或卷曲螺旋（CC)的结构域；信号转导结构域，如核苷酸结合部位（NBS)或 蛋白激酶（PK)结构域。一些抗病基因产物被预测为细胞质蛋白，而另一些通过一个跨膜结 构域（TM)贯穿细胞膜。这些结构域组合能够产生不同类型的R蛋白。根据结构的特性已 经鉴定出至少六种不同类型的 R 基因：I) NBS-LRR，2) LRR-TM-PK，3) LRR-TM，4) CC-TM，5) PK， 6) PK-PK。其中，NBS-LRR类抗病基因是植物体内存在的最大一类抗病基因；这些抗病基因 在结构上的保守性为我们利用抗病基因同源序列法克隆其他作物的抗病基因带来了潜在 可能。在已知分离获得的抗病基因中，小麦抗叶锈病基因 LrlO和马铃薯抗马铃薯X病毒基 因 Rx2就是利用抗病基因同源序列法克隆抗病基因的经典例子，说明利用该法克隆抗病基 因是可行的。
【发明内容】
[0005] 技术问题
[0006] 本发明的目的是利用抗病基因同源序列法快速鉴定瓠瓜枯萎病基因片段或者将 其转化为分子标记及应用。结果一方面可用于瓠瓜抗枯萎病分子标记辅助选择育种，另一 方面也为抗枯萎病基因的克隆提供参考依据。
[0007] 技术方案
[0008] 本发明前期对大量瓠瓜种质资源进行抗病性筛选，在获得高抗瓠瓜枯萎病抗病种 质的基础上，应用抗病基因同源序列法克隆抗枯萎病基因片段，通过与已知抗病基因同源 性及序列比对分析等方法确认；为开发相应的分子标记和利用cDNA末端快速扩增技术获 得抗病基因的全长奠定基础。
[0009] 为了实现上述目标，本发明采用抗病基因同源序列法对瓠瓜抗枯萎病基因进行克 隆，获得了抗枯萎病基因片段或者基因标记4个，片段大小分别为510bp，510bp、504bp和 507bp。以该基因片段序列为基础，开发相应的分子标记，可以进行瓠瓜抗枯萎病分子标记 辅助选择育种；同时利用基因片段或者基因标记进行新的种质资源的创新；结合已有的分 子标记可以实现瓠瓜抗枯萎病基因的分子作图；利用这些基因片段，通过设计基因特异引 物，采用cDNA末端快速扩增技术分离瓠瓜抗枯萎病基因，为通过基因工程改良瓠瓜的抗病 性奠定基础；也为最终解析瓠瓜抗枯萎病基因的分子机理提供了基因资源。
[0010] 本发明的积极效果：
[0011] 1)有利于快速开发与抗病基因紧密连锁的分子标记。通过鉴定的瓠瓜枯萎病基 因，开发相应的共分离功能性标记（SNP、SCAR等），可以快速的用于抗病基因的分子标记辅 助选择，准确性高。
[0012] 2)缩短了瓠瓜抗枯萎病基因的挖掘周期，有利于枯萎病基因的快速鉴定。采用常 规方法（图位克隆、转座子标签等）挖掘抗白粉病基因不仅耗时耗力、效率低，且难以成功。 本发明基于抗病基因同源序列方法快速挖掘瓠瓜抗枯萎病基因，不仅可以缩短时间，还可 以提高枯萎病基因鉴定效率。
[0013] 3)有利于多抗性育种材料的创制。基于新鉴定的枯萎病基因开发的功能性分子标 记，结合已经定位的其他抗病基因的分子标记，进行多抗性育种材料的创制，可以缩短育种 年限，提1?育种效率。
[0014] 4)为阐述瓠瓜抗枯萎病分子机制奠定了基础。鉴定的瓠瓜抗枯萎病基因通过转基 因技术、RNAi、病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing, VIGS)技术等研究抗 枯萎病的分子机制提供了基因资源，有利于快速阐述瓠瓜抗病毒的作用机理。
【附图说明】
[0015] 图1是瓠瓜AlO抗枯萎病基因序列；
[0016] 图2是瓠瓜A13抗枯萎病基因