抑制ADAMTS-5基因的siRNA及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种抑制ADAMTS-5基因的SiRNA及其应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 骨关节炎（Osteoarthritis，OA)是一种严重危害人类健康，目前尚缺乏有效治疗 手段的慢性退行性骨关节病变，迫切需要研宄出能有效防治骨关节炎的新方法。骨关节炎 临床病理特征之一是软骨破坏和hFLS细胞外基质降解，而软骨的破坏最终都来源于胞外 基质的蛋白水解。因此多种蛋白水解酶活性增高引起继发性软骨外基质（extracellular matrix，ECM)的降解异常是软骨退变的直接原因，最终导致覆盖关节骨表面的软骨破坏。白 介素 -I(IL-I)和肿瘤坏死因子-a (TNF-α)都有促进hFLS细胞分解代谢及降解细胞外基 质的作用，有研宄表明在关节炎患者的关节液中发现高浓度的IL-I和TNF-α，它们被认为 是在关节炎发病机制中起关键作用的促炎细胞因子。
[0003] 含I型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶家族（a disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin type lmotifs，ADAMTS)，由一组结构相似 的分泌性锌结合蛋白酶组成，目前已发现19个成员。它们的蛋白结构具有高度的相似性， 蛋白在氨基端信号肽序列后都为前蛋白域结构，蛋白酶原需在胞内经过翻译后的剪切才 能成为有活性的蛋白酶。而且它们都包含有至少一个保守的TSPl样重复基序。位于蛋白 酶羧基端的TSP样重复基序是与细胞外基质成分结合的重要部分。ADAMTS家族在体内以多 种细胞外基质成分为底物，它们在胚胎发育、血管生成、凝血、炎症反应等生理过程中具有 重要功能。
[0004] ADAMTS-5(含I型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶家族-5)是软骨 基质蛋白聚蛋白多糖aggrecan的降解酶。关节软骨中含有大量的aggrecan,它对于关节的 抗压力和张力等物理属性起着重要的作用。骨关节炎和类风湿性关节炎患者中发现存在着 aggrecan的大量降解破坏。在aggrecan的结构域中有两个主要的切割位点，其中一个是 MMPs切割位点，位于Asn341和Phe342 ;而另一个则是聚蛋白多糖酶aggrecanase切割位 点，位于Glu373和Ala374。ADAMTS-5定位于人21q21_q22。聚蛋白多糖酶是治疗关节炎 的新靶点，它的发现使得关节炎的治疗有望取得新的突破，为能从根本上治疗和预防关节 炎提供了基础。脂肪组织也可以产生ADAMTS-5。脂肪细胞的形成和分化中可见ADAMTS-5 及其底物aggrecan表达水平的变化，aggrecan在体外及体内均可以刺激脂肪细胞分化和 成熟，提示ADAMTS-5在脂肪的形成中起着重要的作用。在恶性胶质瘤中，ADAMTS-5的表 达水平明显升高，通过降解aggrecan介导了神经胶质瘤的侵袭与转移。另外，已知蛋白聚 糖酶在其中发生细胞外蛋白降解或者破坏的其它疾病中起作用，例如癌症、哮喘、慢性阻塞 性肺疾病、动脉粥样硬化、与年龄有关的黄斑变性、心肌梗塞、角膜溃疡和其它眼表面疾病、 肝炎、主动脉瘤、腱炎、中枢神经系统疾病、异常伤口愈合、血管生成、再狭窄、肝硬变、多发 性硬化症、肾小球肾炎、移植物抗宿主病、糖尿病、炎性肠病、休克、椎间盘变性、中风、骨质 减少和牙周病。
[0005] ADAM17(解聚素-金属蛋白酶17)是ADAMs家族（解聚素和金属蛋白酶）的一 员，ADAMs家族是近年来发现的一类具有多种功能的细胞膜表面糖蛋白家族，它们共同参与 细胞与细胞、细胞与基质的黏连、细胞融合、胞外基质的降解及信号传导等多种生理过程， 如白细胞的迀移。除此之外，它们还参与了肿瘤形成、增殖及转移等病理过程[Mochizuki S]。ADAM17将膜结合型的TNF- α切断，产生游离型的TNF- α，因此被称作为TNF- α转换 酶（TACE)。游离型的TNF-α引起炎症性细胞因子的过量分泌、细胞凋亡、细胞内信号传导 的障碍等，导致各种疾病，包括风湿性关节炎（RA)、系统性红斑狼疮（SLE)、多发性硬化症、 急性感染病、哮喘、特应性皮炎、牛皮癣等。ADAM17除以TNF-α为底物外，巨噬细胞集落刺 激因子或趋化因子FKN也受ADAM17的调节。因此，认为抑制ADAM17的化合物有望作为炎症 疾病的治疗药。然而，金属蛋白酶家族高度保守，开发选择性的小分子抑制剂已经被证明具 有非常大的挑战。先前使用更广谱的金属蛋白酶抑制剂的试验已经被证明具有组织毒性， 因此开发高度选择性的ADAM17抑制剂（Moss，2008)是需要解决的问题。
[0006] 1998年克雷格·梅洛和安德鲁?法尔发现了基因沉默现象，随后Tuschl和他的同 事在哺乳动物细胞中发现化学合成的19 一 25个碱基的小干扰RNA(SiRNA)，可特异高效的 沉默靶mRNA。从此siRNA被广泛用于基因功能研宄，疾病治疗。siRNA可特异的同序列互 补的靶mRNA结合，并使其降解。长片段的双链RNA被Dicer酶切割成21 - 23个碱基长度 短片段RNA。两条链中同靶mRNA结合的链称为反义链，另一条链称为正义链或信使链。体 外化学合成的siRNA进入细胞后同样发挥RNA干扰作用，而且有效降低了长链RNA引起的 免疫反应。但针对同一基因不同片段位置可设计出多种siRNA，沉默效果有明显差异。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种抑制ADAMTS-5基因的siRNA及其应用。
[0008] 本发明提供一种化学修饰的双链SiRNA分子，是由如下A所示的SiRNA分子中至 少一条链经过如下（1)-(13)所示的任意化学修饰后互补而成的双链siRNA分子：
[0009] A、一种siRNA分子，为如下1)或2)所不：
[0010] I) SEQ ID No. 1所示的RNA单链和SEQ ID No. 2所示的RNA单链互补而成的双链 siRNA分子；
[0011] 2) SEQ ID No. 2所示的RNA单链和与SEQ ID No. 1所示的RNA单链有60%以上同 源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
[0012] 或，SEQ ID No. 1所示的RNA单链和与SEQ ID No. 2所示的RNA单链有60%以上 同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
[0013] 或，与SEQ ID No. 2所示的RNA单链有70%以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No. 1所示的RNA单链有70%以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
[0014] (1)磷酸骨架的硫代磷酸修饰；
[0015] 所述硫代磷酸修饰为磷酸骨架的P-S键代替P-OH键；
[0016] (2)核糖或脱氧核糖的2' -甲氧基修饰；
[0017] (3)核糖或脱氧核糖的2' -氟修饰；
[0018] (4)锁核酸修饰；
[0019] 所述锁核酸修饰为核糖或脱氧核糖的2' -0位和4' -C位通过缩水作用形成环 状结构；
[0020] (5)开环核酸修饰；
[0021] 所述开环核酸修饰为核糖或脱氧核糖的中2' -C和3' -C间的C-C键断裂；
[0022] ⑶叼丨噪修饰；
[0023] 所述吲哚修饰为碱基被吲哚替换；
[0024] (7)碱基的5 -甲基胞嘧啶修饰；
[0025] (8)碱基的5-乙炔基尿嘧啶修饰；
[0026] (9)单链5'末端胆固醇修饰；
[0027] (10)单链3'末端半乳糖修饰；
[0028] (11)单链5'末端多肽修饰；
[0029] 所述多肽具体为从N端到C端的序列为Arg-Gly-Asp的多肽；
[0030] (12)单链5'末端磷酸化修饰；
[0031] (13)单链5'末端荧光标记修饰；
[0032] 所述荧光标记具体为Cy系列荧光标记；
[0033] 所述与SEQ ID No. 2所示的RNA单链有70%以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No. 1所示的RNA单链有70%以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子具体为SEQ ID No. 3所示的单链和SEQ ID No. 4所示的单链互补而成的双链siRNA分子。
[0034] 上述化学修饰的双链siRNA分子中，所述化学修饰后互补而成的双链siRNA分子 的正义链和反义链分别具有如下Bl和Cl所示的序列：
[0035] Bl、5'-K-LLMUUUAUGUGGGCAUPMQdTdT-3' ；
[0036] Cl、5,-R-MQLAUGCCCACAUAAAQPPdTdT-3,；
[0037] 所述K为无修饰或5'末端胆固醇修饰；
[0038] 所述R为5 '末端磷酸化修饰；
[0039] 所述dT为胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸；
[0040] 所述L、M、P和Q分别为脱氧核糖的2' -甲氧基修饰的鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸、脱 氧核糖的2' -甲氧基修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖的2' -甲氧基修饰的胞嘧啶 脱氧核糖核苷酸和核糖的2' -甲氧基修饰的尿嘧啶核糖核苷酸；
[0041] 或，
[0042] 所述L、M、P和Q分别为脱氧核糖的2' -甲氧基修饰和磷酸骨架的硫代磷酸修饰 的鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖的2' -甲氧基修饰和磷酸骨架的硫代磷酸修饰的腺嘌 呤脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖的2' -甲氧基修饰和磷酸骨架的硫代磷酸修饰的胞嘧啶脱氧 核糖核苷酸和核糖的2' -甲氧基修饰和磷酸骨架的硫代磷酸修饰的尿嘧啶核糖核苷酸；
[0043] 所述反义链为同ADAMTS-5(含I型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白 酶家族-5)mRNA结合的单链，所述正义链为与所述反义链互补结合的单链。
[0044] 一种siRNA分子也属于本发明的保护范围，为如下（1)或（2)所示：
[0045] (I) SEQ ID No. 1所示的RNA单链和SEQ ID No. 2所示的RNA单链互补而成的双链 siRNA分子；
[0046] (2) SEQ ID No. 2所示的RNA单链和与SEQ ID No. 1所示的RNA单链有60%以上 同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
[0047] 或，SEQ ID No. 1所示的RNA单链和与SEQ ID No. 2所示的RNA单链有60%以上 同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
[0048] 或，与SEQ ID No. 2所示的RNA单链有70%以上同源性的RNA单链和与SEQ ID No. 1所示的RNA单链有70%以上同源性的RNA单链互补而成的双链siRNA分子；
[0049] 所述siRNA分子应用于制备预防和/或治疗炎症的产品；
[0050] 所述炎症具体为关节炎症，再具体为骨关节炎。
[0051] 含有上述siRNA分子的载体也属于本发明的保护范围；
[0052] 所述载体为阳离子脂质体、壳聚糖纳米粒、多肽、聚合物材料。
[0053] 上述siRNA分子中，所述与SEQ ID No. 2所示的RNA单链有70%以上同源性的 RNA单链和与SEQ ID No. 1所示的RNA单链有70%以上同源性的RNA单链互补而成的双链