抑制cd44基因的寡聚核酸及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体是涉及一类抑制CD44基因的寡聚核酸及其应用。
【背景技术】
[0002] 骨关节炎（OA)是世界上致残的重要原因之一，大约多于10%的老年人有骨关节 炎的症状。风湿性关节炎（RA)是一个慢性炎症疾病，影响着世界上约0.5%到1 %的成年 人，通常导致关节损坏并危及生活质量。多种炎性细胞因子如TNF-a . IL-L IL-6等参与了 RA和OA的发病和进展，其通过激活免疫细胞及诱导金属蛋白酶产生而促进关节破坏、滑膜 炎、血管增生等。多种炎性细胞因子如TNF-a . IL-L IL-6等参与了 RA和OA的发病和进展， 其通过激活免疫细胞及诱导金属蛋白酶产生而促进关节破坏、滑膜炎、血管增生等。
[0003] ⑶44分子是广泛表达于细胞表面的I类跨膜单链糖蛋白，其分布包括淋巴细胞、 单核细胞、红细胞、成纤维细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、神经胶质细胞及肿瘤细胞等。CD44 分子最初作为粘附分子，介导细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的相互作用，随着研 究发现，CD44分子也可以参与细胞间的信号传导，并与肿瘤的生长、侵袭、转移以及造血干 细胞的归巢等密切相关；研究表明CD44作为多种肿瘤干细胞的标志物，是潜在的肿瘤治疗 靶点，且CD44的生物学功能及其表达调控模式因肿瘤种类以及生长条件的不同而有所不 同.另外，CD44还与炎症因子的释放、淋巴细胞的激活、伤口的愈合、自身免疫病等相关。
[0004] 在过去的20多年里，大多数新型治疗方法的研发工作是关于疾病缓解的抗关节 炎药物（DMRDs)和疾病缓解的抗风湿性关节炎的药物（DMOADs)。到目前为止，制药业在研 制有效安全的疾病缓和性药物（DMOADs)上并不成功，致使成千上万的病人仍受到该严重 致残性疾病所带来的痛苦。随着新途径和给药方法的应用，在该治疗领域预期将有更多的 发展，这为可阻断、逆转疾病过程并缓和疾病的药物，如siRNA提供了巨大的发展空间。
[0005] RNA干预是生命科学上具革命意义的发现，成为研究基因功能的重要工具，它能够 导致生物体，哺乳动物细胞，甚至动物中的基因失活。RNA干预技术可应用于治疗有关有害 基因过度表达的疾病，具有创造人类疾病治疗新方法的潜力。
[0006] 在本发明中，我们提供一种全新的siRNA作为关节炎及相关炎症的治疗药物；一 种通过骨关节腔局部注射siRNA及其制剂抑制炎症因子表达，实现了对关节炎症的治疗作 用。
【发明内容】
[0007] 本发明目的旨在提供一类抑制⑶44基因表达的寡聚核酸。
[0008] 实现上述目的的技术方案如下。
[0009] -类抑制CD44基因的寡聚核酸，所述寡聚核酸为双链RNA，所述寡聚核酸的碱基 组成为：
[0010] 包括有⑴含有SEQ. ID NO. 18所示的70%以上同源的反义链；（2)含有与⑴所 述反义链反向互补配对的寡聚核酸50%以上序列同源的正义链；且（3)所述（1)和（2)寡 聚核酸经过退火后能形成双链结构。
[0011] 在其中一个实施例中，所述寡聚核酸包括有（1)由SEQ. ID NO. 18碱基序列所示的 反义链；⑵含有SEQ. ID NO. 17所示至少50%序列同源构成的正义链；且⑶正义链和反 义链经过退火后能形成双链结构。
[0012] 在其中一个实施例中，所述寡聚核酸包括有（1)含有SEQ. ID NO. 18所示至少70% 序列同源构成的反义链；（2)由SEQ. ID NO. 17碱基序列所示的正义链；且（3)正义链和反 义链经过退火后能形成双链结构。
[0013] 在其中一个实施例中，所述寡聚核酸包括有（1)含有SEQ. ID NO. 18所示至少70% 序列同源构成的反义链；（2)含有SEQ. ID NO. 17所示至少70%序列同源构成的正义链；且 (3)正义链和反义链经过退火后能形成双链结构。
[0014] 在其中一个实施例中，所述寡聚核酸由碱基组成如SEQ. ID NO. 18所示的反义链以 及碱基组成如SEQ. ID NO. 17所示的正义链组成。
[0015] 在其中一个实施例中，所述寡聚核酸由碱基组成如siRNA-⑶-28、siRNA-⑶-36、 siRNA-CD-39、siRNA-CD-40、siRNA-CD-41、siRNA-CD-42 所示。
[0016] 本发明提供寡聚核酸是双链RNA，其中所述双链RNA中的特征为：反义链含有核苷 酸序列为"51衝此(：呢464(^呢(^63'"如序列表中序列18，或与其具有至少70%以上同源 性的同源序列；正义链含有与反义链反向互补链具有50%同源性以上的核苷酸序列。上述 寡聚核酸可经过（1)-(4)中任一种或多种修饰：
[0017] 1)对所述寡聚核酸的连接核苷酸的磷酸二酯键进行修饰，优选将所述磷酸二酯键 的氧用硫取代；
[0018] 2)对所述寡聚核酸的所含核糖进行修饰，优选将核糖2'_0H用甲氧基或氟取代或 者对所述2' -OH进行脱氧修饰，或以开环核酸（UNA)进行修饰；
[0019] 3)对所述寡聚核酸的核苷酸碱基的修饰，优选胞嘧啶5位甲基修饰、5-乙炔基尿 嘧啶、吲哚修饰；
[0020] 4)对所述寡聚核酸末端修饰，优选末端连接胆固醇、多肽、荧光、糖、抗体分子、磷 酸化修饰；
[0021] 5)本发明所述寡聚核酸在3'末端可以添加悬挂碱基，优选悬挂碱基为dTdT。
[0022] 本发明的另一目的还在于提供一种有抑制⑶44基因表达功能的DNA。
[0023] 具体技术方案如下。
[0024] 可表达上述任一种寡聚核酸且具有抑制⑶44基因表达功能的DNA。
[0025] 本发明的另一目的还在于提供一种具有抑制⑶44基因表达功能的载体。
[0026] 具体技术方案如下。
[0027] 含有上述任一种寡聚核酸或者上述DNA的载体，所述载体为脂质体、聚合物材料、 多肽、纳米材料。其中脂质体载体材料为本领域常用的阳离子脂质体，优选lip〇2000 ;聚合 物载体材料优选透明质酸或聚赖氨酸；多肽材料优选RGD ;纳米材料优选为壳聚糖纳米粒。
[0028] 本发明的另一目的还在于提供一种具有抑制⑶44基因表达功能的组合物。具体 技术方案如下。
[0029] -种具有抑制⑶44基因表达功能的组合物，含有上述任一种寡聚核酸或者上述 DNA，以及药学上可接受的载体。
[0030] 本发明的另一目的还在于提供上述寡聚核酸、DNA、载体或者组合物的应用。
[0031] 具体技术方案如下。
[0032] 上述寡聚核酸、DNA、载体或者组合物在制备抑制细胞中⑶44基因表达制品中的 应用。
[0033] 上述寡聚核酸、DNA、载体或者组合物在制备调节细胞中⑶44基因制品中的应用。
[0034] 上述寡聚核酸、DNA、载体或者组合物在制备诊断⑶44基因异常引发的疾病⑶44 的试剂中的应用。
[0035] 上述寡聚核酸、DNA、载体或者组合物制备治疗CD44基因异常引发的疾病的药物 中的应用。
[0036] 在其中一个实施例中，所述CD44基因异常引发的疾病可选自炎症、癌症。
[0037] 在其中一个实施例中，所述CD44基因异常引发的疾病为关节炎、风湿性关节炎或 滑膜炎。
[0038] 本发明针对CD44基因 CDs区域内的不同位置进行优化设计，选择了 9对针对人与 鼠同源基因的siRNA进行筛选试验。研究结果表明：与阴性对照SiRNA相比，反义链含有核 苷酸序列为"5' AUUUCCUGAGACUUGCUGG3' "的siRNA-CD-06对CD44基因 mRNA表达抑制效果 最强，对⑶44基因的mRNA沉默效率达87 % (实施例二）。在免疫印迹（western blotting) 实验中，与空白和阴性对照组相比加入siRNA-⑶-06后，⑶44蛋白表达水平明显下降，差异 有显著性（P〈〇. 05)(实施例三）。经IL l-α刺激后的细胞中加入siRNA-⑶-06,与加入阴 性对照寡聚核酸相比，细胞炎症因子TNF、COX-2、IL-I β含量明显下降，表明siRNA-⑶-06 具有消除炎症效果（实施例四）。在实施例五中，本发明对序列进行了优化，实验结果表明： 反义链含"5' AUUUCCUGAGACUUGCUGG3'的同源序列的双链寡核酸对CD44基因 mRNA具有抑 制效果；正义链与反义链反向完全互补或部分仅部分互补对CD44基因 mRNA也具有抑制效 果，且含有与反义链70%同源序列的双链RNA也具有抑制效果。实施例六应用质粒载体表 达"5' AUUUCCUGAGACUUGCUGG3' "序列，在细胞中也具有良好的CD44基因的mRNA抑制效果。 实施例七研究了化学修饰对核酸沉默CD44基因效果的影响，结果表明：经适当的修饰后的 寡聚核酸对CD44基因具有良好的抑制作用。实施例八的研究表明，经化学修饰后，本发明 的siRNA在血清中的稳定性显著提高。实施例九和实施例十为siRNA的活体大鼠试验，在 关节炎模型大鼠的关节腔内单独或混合注射含反义链" 5' AUUUCCUGAGACUUGCUGG3' "的化学 修饰物，后续的组织病理切片和关节液炎症因子含量检测试验表明，寡聚核酸在大鼠体内 有明显的炎症抑制作用。
[0039] 本发明的创新性主要体现在：1、本发明运用基因沉默技术，经过大量的设计、筛 选、分析与验证发现了一类对CD44有显著抑制作用的寡聚核酸，在一类hFLS细胞中，抑制 效率达到88%，且与该序列具有70%以上同源性的核酸序列都能起到基因沉默的效果，表 明本发明是一类对C