控制苹果果肉有机酸含量的苹果酸转运体基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及苹果分子遗传育种领域，尤其涉及一种控制苹果果肉有机酸含量 的苹果酸转运体基因及其应用。
【背景技术】
[0002] 苹果是世界上种植与消费量最大的水果，具有高度杂合、自交不亲和以及幼年期 较长等特点。这些特点尤其是童期长严重制约着苹果遗传育种及新品种的培育工作。果实 品质直接决定果实的商业价值，并影响消费市场上的份额。果实中的酸、糖及香气物质等组 分的含量是决定果实品质的主要因素。苹果的有机酸含量是其中影响口感品质的重要因 素，对消费市场份额、果汁加工品质等方面具有重要的影响。
[0003] 成熟果实中含有的主要有机酸是苹果酸，约占总酸含量的90%以上。至今，人们采 用正向和反向遗传学方法对决定苹果果实酸度的基因开展了许多研究。利用cDNA芯片对 高酸、低酸等品种果实表达谱差异进行了分析，结果发现姻和姻河能是苹果酸 代谢途径中的关键基因；也有研究认为姻是苹果酸降解的关键基因，而/??是苹果 酸合成关键基因。但/??;姻等有机酸代谢相关基因的酶活在低酸苹果品 种'Usterapfel'和其高酸突变体之间没有差异；此外，利用番茄单片段渐渗系进行基因定 位研究，鉴定的果实酸度QTLs区域都不包含酸代谢结构基因，故可推断苹果酸代谢途径中 的结构基因对果实酸度不起决定作用。
[0004] 液泡是苹果酸和柠檬酸主要贮藏场所。有机酸向液泡中转运，需要多种转运体和 质子泵之间的协同作用。在拟南芥中，液泡膜二羧酸转运体切r)和铝诱导苹果酸转运 体和都位于液泡膜上，分别起着苹果酸转运体和苹果酸通道的功能，将 它们敲除和过量表达后会造成叶片中苹果酸的积累减少。苹果等果树中也包含这两种转运 体基因。我们发现其中苹果McWZ#79的转录本在果实酸度性状有分离的群体中存在着表达 量和序列的差异，可能与果实的酸度具有重要的联系。
[0005] 目前已经有报道说存在着可能控制苹果果实中苹果酸含量的候选基因，但未能证 实其功能机制。而且在本发明报道之前尚未有利用分子标记对自然群体中苹果酸含量进 行分析的报道。为了在苹果果树育种中克服具有高度杂合、自交不亲和以及较长的幼年期 的特点，本发明通过关联分析获得与果实中苹果酸含量相关的候选基因，发展候选基因内 部的CAPS及下游的SSR标记，进行单倍体型与苹果酸含量的相关分析，提出通过植株不同 的单倍体型进行苹果果树的标记辅助选择遗传育种。同时本发明通过将该基因转化到酵母 中，验证了该基因的存在能使液泡的pH值发生显著变化，从而间接证明了其调节果肉酸度 的功能。
[0006] 分子遗传学理论与技术应用于农作物育种的实践并没有很长时间，但已经显示了 强大的技术潜力与广阔的应用前景。在早期发展中得到应用的分子遗传学技术主要是分子 标记，育种研究通过尚不完善的分子标记技术构建了很多遗传连锁图谱，获得了部分重要 农艺性状的基因定位。随着基因组学的理论和技术获得提升，积累了越来越多的基因组序 列和变异的数据，作物育种正在呈现全新的面貌。在果树育种中，基于全基因组关联分析和 分子标记辅助选择的强大技术平台，使得育种者可以用之前难以想象的速度深入挖掘重要 基因，并完成分子育种和分子设计，标记辅助选择大大加快了果树的育种进程。
[0007] 本发明就是基于这些新技术的果树分子育种的实践，获得了之前从未能得到的果 肉酸度控制基因。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种控制苹果果 肉有机酸含量的苹果酸转运体基因及其应用。
[0009] 本发明的目的是这样实现的： 一、控制苹果果肉有机酸含量的苹果酸转运体基因（MdAlMT9) 苹果果肉的主要有机酸是苹果酸，本发明参考以前的育种研究者对苹果果肉酸含量进 行QTL (数量性状遗传)定位的结果，通过遗传学方法，借助本申请人之前构建的BAC (细菌 人工染色体）文库，用染色体步进的方法逼近该基因，最终克隆获得了一个能决定苹果果肉 酸含量的基因，即前述的MdAlMT9苹果酸转运体基因，其序列见SEQ ID NO. 1和NO. 2。
[0010] 具体的说： 通过HPLC (高效液相色谱）确定作图群体的成熟苹果果肉中有机酸的含量与组分；通 过Q-PCR (荧光定量实时PCR)和race (RNA末端快速克隆）等方法确定有机酸代谢和转运 过程的关键基因的序列全长以及在苹果果实成熟过程中的表达模式。
[0011] 依据上述数据对苹果的作图群体以及其他群体进行QTL定位；成功将高酸性状定 位于第16号染色体顶端约1200kb的区间；通过RNA-seq数据辅助，找到最有可能的候选基 因，根据注释命名为量沒7#79基因；根据该基因座下游的简单重复序列SSR分子标记，设计 引物进行聚丙烯酰胺凝胶PAGE条带分析，将此标记命名为WBG90 ;根据该基因内部存在的 一个多态性位点设计CAPS标记引物，将该标记命名为CAPS-9 ;同时发现CAPS-9的基因型 中一种能导致该基因的翻译提前终止；在后代群体中分析发现WBG90与CAPS-9和高酸/低 酸性状完全关联，表现为：根据分子标记的多态性，对群体中苹果酸含量分析得到：GG> AG > AA (CAPS-9 的分型结果）与（TC) 17 (TC) 17> (TC) 20 (TC) 17 > (TC) 20 (TC) 20 (WBG90 的 分型结果）；对这两个标记组成的单倍体型与酸含量分析得：HapA与HapD对果实中酸含量 影响最大。因此该组分析标记可被用于苹果的杂交育种中。
[0012] 二、苹果酸转运体基因的应用 根据苹果酸转运体基因的特点和功能，其应用是： 1、根据其序列设计分子标记(其引物序列见附表1)，用于育种中的标记辅助筛选，在幼 苗初期即能推断将来的果实酸含量，同时也能应用于优秀农艺性状的富集筛选； 标记的选择见前述。
[0013] 2、其表达蛋白序列及基因功能的应用，根据该基因的表达量或转录本的序列亚型 检测筛选酸度相关表型，或通过转基因方法提高或降低该基因表达量以获取期望的果肉酸 度性状。
[0014] 本应用的实现是根据MdAlMT9基因的序列并借助苹果的全基因组序列，以 及MdAlMT9的基因结构设计引物，PCR扩增MdAlMT9全长，连接到克隆载体测序。构建 MdAlMT9的全长真核超表达载体，转化酵母，通过对酵母的液泡进行提取，测定其pH