活细胞水平上改变基因启动子内特定顺式作用元件甲基化修饰水平的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及活细胞水平上改变基因启动子内特定顺式作用元 件甲基化修饰水平的方法。
【背景技术】
[0002] 胶质细胞系源性神经营养因子（glial cell -line derived neurotrophic factor，⑶NF)属于转化生长因子（TGF-β)超家族成员，是一种新型的神经营养因子，其基 因序列首次从大鼠 B49胶质细胞系中克隆获得。在人类细胞中，GDNF为单拷贝基因，位于 5号染色体pl2-pl3. 1区，含有2个启动子和6个外显子，其中启动子I区位于第IV外显子 上游；启动子II区位于第I外显子上游，含有两个增强子、两个沉默子，且存在多个转录因 子结合位点，在转录起始上发挥主要作用。近来的研宄发现，GDNF与胶质瘤的发生发展密 切相关，作为胶质瘤细胞强有力的促增殖和迀移因子，它在胶质瘤细胞中的表达量显著高 于正常胶质细胞（蛋白表达水平升高约5倍）。最近的研宄表明，GDNF基因异常高表达主 要受转录水平的调控 [8]，但其转录上调的分子机制至今仍不清楚。
[0003] 基因的异常高转录通常由基因突变或表观遗传修饰改变而引发。我们前期的研宄 发现，在胶质瘤细胞中，GDNF基因的DNA拷贝数以及启动子、编码区的序列都未发生改变， 表明⑶NF基因的异常高转录与基因突变无关。mi等的研宄显示：⑶NF基因5'端发生的甲 基化修饰能够促进脑组织发育及神经的发生与增殖，与⑶NF基因表达上调的生物学作用 相似。此外，研宄表明，胶质瘤细胞中基因启动子区甲基化程度改变能够调节该基因的转录 水平，由此我们推测GDNF基因启动子区可能发生了甲基化修饰的改变，并且这种改变参与 了胶质瘤细胞中该基因的高转录调控。最近，我们的研宄证实了以上推测，发现与正常脑组 织相比，不同级别胶质瘤组织中GDNF基因启动子II区内沉默子、增强子等顺式作用元件的 DNA甲基化修饰水平发生了不同程度的改变（增强子甲基化水平下降，沉默子甲基化水平 上升），且这种改变影响了转录因子与之的结合，进一步的体外细胞实验表明GDNF基因启 动子II区甲基化水平与该基因的转录水平直接相关。然而，启动子II区中各种顺式作用 元件甲基化修饰改变在调节GDNF基因高转录过程中所贡献的份额是多少？至今我们还不 清楚。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种活细胞水平上改变基因启动子内特定顺式作用元件甲 基化修饰水平的方法。
[0005] 本发明的另一目的是提供该方法在探讨同一启动子内不同顺式作用元件甲基化 修饰水平变化对基因转录活性的影响中的应用。
[0006] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：
[0007] 活细胞水平上改变基因启动子内特定顺式作用元件甲基化修饰水平的方法，包含 以下步骤：
[0008] (1)构建目的基因野生型启动子荧光素酶载体：合成基因野生型启动子，将其克 隆到荧光素酶载体中，获得目的基因野生型启动子荧光素酶载体；
[0009] (2)构建带有特定限制性内切酶位点的目的基因突变型启动子荧光素酶载体：以 目的基因野生型启动子荧光素酶载体为模板，利用基因定点突变和拼接PCR法，获得了目 的基因突变型启动子序列，使该启动子内各顺式作用元件两端都带有甲基化不敏感的单一 限制性内切酶位点，将该突变启动子克隆至荧光素酶载体获得带有特定限制性内切酶位点 的目的基因突变型启动子荧光素酶载体；
[0010] (3)目的基因启动子区不同顺式作用元件的甲基化修饰：利用目的基因突变型启 动子区各顺式作用元件两端特定的甲基化不敏感的单一限制性内切酶位点对应的内切酶 大量双酶切带有特定限制性内切酶位点的目的基因突变型启动子荧光素酶载体，分别纯化 回收载体骨架和各顺式作用元件，随后利用CpG甲基转移酶对各顺式作用元件进行甲基化 处理，并通过T4连接酶将甲基化的各顺式作用元件分别接回相应的荧光素酶载体骨架上， 获得基因启动子区仅特定顺式作用元件高甲基化（>90%)的环形荧光素酶质粒。
[0011] 其中，所述的启动子内各顺式作用元件优选包括整个启动子、增强子、沉默子和核 心启动子；所述的CpG甲基转移酶优选M. SssI (高度甲基化处理），M. Hpa I (中度甲基化处 理）或M. Hpa II (低度甲基化处理）；进一步优选M. SssI (高度甲基化处理）。
[0012] 所述的方法，还优选包括将步骤（3)获得的基因启动子区仅特定顺式作用元件高 甲基化（>90% )的环形荧光素酶质粒直接转染U251细胞，进行荧光素酶报告基因检测，分 析各顺式作用元件甲基化对基因启动子启动活性的影响。
[0013] 所述的基因启动子区仅特定顺式作用元件高甲基化（>90% )的环形荧光素酶质 粒优选包括沉默子高甲基化且增强子和核心启动子未甲基化的基因启动子区环形质粒、增 强子高甲基化且沉默子和核心启动子未甲基化的基因启动子区环形质粒、核心启动子高甲 基化且沉默子和增强子未甲基化的基因启动子区环形质粒、全启动子高甲基化的基因启动 子区环形质粒。
[0014] 所述的甲基化不敏感的限制性内切酶位点选自KpnI、SacI、MluI、XhoI、BglII和 HindIII0
[0015] 所述的荧光素酶载体为pGL3-basic载体。
[0016] 所述的基因启动子优选⑶NF基因启动子II区（-1300/+149bp)。
[0017] 所述的方法，进一步优选包含以下步骤：
[0018] (1)利用全基因合成技术，合成5'端添加了 Kpn I酶切位点，3'端添加了 Hind III酶切位点的人类⑶NF基因启动子II区序列（-1300/+149bp)，所述的⑶NF基因启动 子II区序列在GenBank中序列号为AF053749 ;将其TA克隆至pMD19T-simple载体，经双酶 切和测序鉴定成功后，命名为 pMD19T_GDNF-promoter Il-wt ;利用 pMD19T_GDNF-promoter Il-wt载体将⑶NF基因野生型启动子II区片段亚克隆至pGL3-Basic载体中，测序验证获 得含有⑶NF基因野生型启动子II区荧光素酶载体pGL3-GDNF-promoter Il-wt ;
[0019] (2)通过PCR突变引物在整个启动子II、增强子II、沉默子II和核心启动 子II两端引入甲基化不敏感的单一酶切位点，经两轮PCR获得突变型GDNF基因启动 子II区序列；将获得的突变型⑶NF基因启动子II区序列克隆到pMDIOT-simple载 体，命名为pMD19T-GDNF-promoterII-mt，随后亚克隆至pGL3_basic载体中，命名为 pGL3-GDNF-promoter II-mt ；
[0020] (3)利用突变型⑶NF基因启动子II区不同顺式作用元件两端对应的甲基化不敏 感的单一限制性内切酶，对pGL3-GDNF-promoter II-mt质粒进行双酶切处理，经琼脂糖电 泳分离后分别回收载体骨架和对应的顺式作用元件片段；利用M. SssI分别对回收的GDNF 基因启动子II区的各个顺式作用元件序列进行甲基化处理，并通过T4连接酶将其接回相 应的荧光素酶载体骨架上。通过凝胶电泳的方式分离连接组分，并回收迀移速率较快的环 形质粒DNA，BSP检验环形质粒DNA中⑶NF基因启动子II区各顺式作用元件的甲基化水 平；
[0021] (4)将上一步获得的GDNF基因启动子区仅特定顺式作用元件高甲基化的环形荧 光素酶质粒直接转染U251细胞，48h后进行荧光素酶报告基因检测，分析各顺式作用元件 甲基化对GDNF基因启动子II区启动活性的影响。
[0022] 其中，步骤⑵所述的两轮PCR获得突变型GDNF基因启动子II区序列的具体 方法为：以野生型pMD19T-GDNF_promoter Il-wt载体为模版，分别以⑶NF-Kpn I-wt-Fl/ GDNF-Sac I-mu-(-1165)-R， GDNF-Sac I-mu-(-1165)-F/GDNF-Mlu I-mu-(-329)-R， ⑶NF-Mlu I-mu-(-329)-F/⑶NF-Xho I-mu-(-189)-R，⑶NF-Xho I-mu-(-189)-F/⑶NF-Bgl II-mu-(+45)-R，⑶NF-Bg I II-mu-(+45)-F/GDNF-Hind III-wt-R24为引物，PCR扩增5段带 有重复序列的特异性产物，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，用AXGGEN胶回收试剂盒回收目 的片段。以回收的5条PCR产物为模板，⑶NF-Kpn Iit-Fl和⑶NF-Hind III-wt-R24为引 物，PCR扩增获得突变型⑶NF基因启动子II区序列；所述的⑶NF-KpnI-wt-Fl序列如SEQ ID NO. 1 所示，GDNF-HindIII-wt-R24 序列如 SEQ ID NO. 2 所示，GDNF-SacI-mt-(-1165)-F 序列如 SEQ ID N0.3 所示，⑶NF-SacI-mt-(-1165)-R 序列如 SEQ ID N0.4 所示， ⑶NF-MluI-mt-(-329)-F 序列如 SEQ ID N0·5所示，⑶NF-MluI-mt-(-329)-R序列如SE