特异工程噬菌体检测大肠杆菌o157的方法
【技术领域】
[0001]本发明属生物技术领域，具体涉及一种用于检测大肠杆菌0157的特异工程噬菌体及检测大肠杆菌0157的方法。
【背景技术】
[0002]大肠杆菌0157是肠出血性大肠杆菌最主要的一种血清型。大肠杆菌0157进入肠道大量繁殖后产生志贺样毒素，损伤肠道表皮毛细血管，进而引起纤维蛋白在多种器官内沉着，引起出血性肠炎，最终可能发展为血小板减少和急性肾衰竭。大肠杆菌是重要的食源性病原菌，其中大肠杆菌0157是致病性最强的一种血清型。全世界每年都有因食用被大肠杆菌0157污染的食物而致病甚至死亡的报道，对人们的生命和健康造成极大的威胁。人对大肠杆菌0157的感染剂量很低，只需要10个活菌就可致病，对于免疫力低下的老人和小孩甚至更低。
[0003]噬菌体是一种细菌病毒，是世界上数量最庞大的非细胞生命，有细菌的地方就会有相应噬菌体存在。噬菌体鉴定细菌的传统方法就是噬菌体分型。噬菌体与宿主之间特异性的相互作用是噬菌体分型的基础，能用不同类型的噬菌体识别未知的细菌。在一个典型的噬菌体分型测试中，各种类型宿主谱已知的噬菌体分别用来感染细菌样品。如果这种细菌在噬菌体的宿主谱范围内，细菌将会被噬菌体侵染，在双层琼脂培养板中可观察到由细胞裂解形成的噬菌斑。根据哪些种类的噬菌体能成功形成噬菌斑，可对样品中的菌株进行分类。
[0004]宿主菌破裂后释放出子代噬菌体，可以用噬菌体数量的增加作为感染事件发生的指示物。因此在样品中加入靶细菌特异性的噬菌体，再通过检测噬菌体数量是否增加来判断样品中是否存在靶细菌。在开始检测时，先预计需要检测哪种靶细菌，再加入它专一性的噬菌体。在宿主细胞裂解释放子代噬菌体之前，加入病毒灭活剂以除去样品混合物中的游离噬菌体。那些成功侵染宿主菌将其基因组注入宿主细胞的噬菌体因在细胞内而被保护起来。中和混合物中的病毒灭活剂，并加入噬菌体的宿主细胞(辅助细胞)。孵育后，噬菌体在最初感染的靶细胞中复制，随后细胞裂解释放出子代噬菌体，子代噬菌体再次感染后加入的辅助细胞，在双层琼脂培养皿中形成噬菌斑。样品中每个靶细菌都能形成一个噬菌斑。传统的噬菌体分型法需要样品中有足够多数量的靶细菌以形成菌苔，而新型的噬菌体分型法只需要样品中有少量的靶细菌就能进行检测，加入辅助细胞二次感染将初始的感染信号放大。以噬菌体扩增技术为基础的诊断试剂盒已经开始商业化使用，如结核分枝杆菌的抗药性检测，以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的检测。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种用于检测大肠杆菌0157的特异工程噬菌体及检测大肠杆菌0157的方法。
[0006]一种用于同源重组噬菌体JLl的质粒，它是由下述方法制备的: 1)用引物:
Pl:gcggggttaaagcggaaagtcaatP2:tcaacgcggtcaatagcac
以噬菌体JLl基因组DNA为模板进行PCR扩增获得其碱基序列如序列表SEQUENCE N0.1所不的■菌体几I衣壳蛋白基因；
2)将衣壳蛋白基因插入PMD18-T载体中；
3)将插入了衣壳蛋白基因的PMD18-T载体和序列表SEQUENCEN0.2所示的荧光蛋白基因，用BssSI酶切后，连接，得PMD18-T-衣壳蛋白基因-绿色荧光蛋白基因-衣壳蛋白基因质粒。
[0007]一种用于检测大肠杆菌0157的特异工程噬菌体，它是用下述方法制备的:
将一种用于同源重组噬菌体JLl的质粒转化至大肠杆菌0157感受态细胞中；接种到液体LB培养基中培养，加入噬菌体几1，孵育10 min后，用双层琼脂法铺板，筛选同源重组成功的噬菌体。
[0008]特异工程噬菌体检测大肠杆菌0157的方法，将待检样品接种到液体LB培养基中，37°C恒温水浴摇床200 rpm振荡培养，直到0D600为0.2 ;加入一种用于检测大肠杆菌0157的特异工程噬菌体悬浮液，浸染，荧光显微镜观察样品中是否有荧光出现。
[0009]本发明提供了特异工程噬菌体检测大肠杆菌0157的方法，采用一种用于同源重组噬菌体几I的质粒，该质粒是由下述方法制备的:以噬菌体几I基因组DNA为模板进行PCR扩增获得其碱基序列如序列表I所示的噬菌体JLl衣壳蛋白基因；将衣壳蛋白基因插入pMD18-T载体中；将插入了衣壳蛋白基因的pMD18-T载体和序列表2所示的荧光蛋白基因，用BssSI酶切后，连接，得PMD18-T-衣壳蛋白基因-绿色荧光蛋白基因-衣壳蛋白基因质粒。同源重组噬菌体几1，用筛选同源重组成功的噬菌体，检出大肠杆菌0157特异性强，检出限可达14 CFU/ mLo
【附图说明】
[0010]图1为衣壳蛋白基因扩增产物，其中:1，2为753bp噬菌体衣壳蛋白基因扩增产物，M 为 DNA marker ；
图2为pMD18-T-衣壳蛋白基因-绿色荧光蛋白基因-衣壳蛋白基因质粒结构示意图；图3为同源重组后菌落PCR验证；M:DNA Marker ;1_3是以M13为引物从pMD18_T质粒中扩增的片段
图4为重组成功后噬菌体PCR扩增产物；
图5为工程噬菌体检测大肠杆菌0157的荧光显微镜照片；图中绿色杆状物体为被噬菌体侵染后的大肠杆菌0157发出的绿色焚光。
【具体实施方式】
[0011]实施例1大肠杆菌0157噬菌体JLl衣壳蛋白基因的扩增
针对大肠杆菌0157噬菌体JLl衣壳蛋白基因序列设计引物并对其进行PCR扩增，其上游引物序列为:5’ - gcggggttaaagcggaaagtcaat ;下游引物序列为:5’ -tcaacgcggtcaatagcac。以■菌体JLl基因组DNA为模板进行PCR扩增，目的片段全长753bp，将该PCR产物纯化回收后连接到pMD18-T载体。该衣壳蛋白基因序列含有单一 BssSI限制性内切酶酶切位点，其碱基序列如序列表SEQUENCE N0.1所示。
[0012]实施例2增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的扩增
根据增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)序列设计如下引物，上游引物为:5’ -CACGAGatggtgagcagcaagggcgaggag，下游引物为 5’ -ttacttgtacagctcgtccatCTCGTG，其中上游引物的5’端和下游引物的3’端含有BssSI酶切位点。以含有增强型绿色荧光蛋白基因的质粒pEGFP-ΝΙ为模板进行PCR扩增，其扩增序列如序列表SEQUENCE N0.2所示。
[0013]实施例3将EGFP基因插入到含有噬菌体衣壳蛋白基因的pMD18-T载体上，构建同源重组质粒
将EGFP基因插入到含有噬菌体衣壳蛋白基因的pMD18-T载体上，构建同源重组质粒。
[0014]首先用限制性内切酶BssSI对I中构建的含有噬菌体衣壳蛋白基因的PMD18-T载体进行酶切，然后将2中扩增序列连接到酶切后的载体上。得到噬菌体衣壳蛋白基因-绿色荧光蛋白基因-噬菌体衣壳蛋白基因，构建用于同源重组的质粒(PMD18-T-衣壳蛋白基因-绿色荧光蛋白基因-衣壳蛋白基因质粒)。
[0015]实施例4用于同源重组的质粒转入大肠杆菌0157感受态细胞用上述同源重组质粒，对大肠杆菌0157感受态细胞进行转化，其特征在于:
(I)将PMD18-T-衣壳蛋白基因-绿色荧光蛋白基因-衣壳蛋白基因质粒转入大肠杆菌0157感受态细胞中。
[0016](2)将转化成功的菌株加入甘油保菌液，_20°C低温保存。
[0017]实施例5同源重组、筛选同源重组成功的噬菌体
将实施例4中转化的大肠杆菌0157同噬菌体JLl同源重组
(I)将转化有同源重组质粒的大肠杆菌0157接种到液体LB培养基37 °C水浴摇床振荡培养。
[0018](2)加入噬菌体几1。37°C恒温水浴箱中孵育10 min后，用双层琼脂法铺板。
[0019](3)挑取培养皿中的噬菌斑，用噬菌体衣壳蛋白基因上游引物和下游引物进行PCR检测，筛选同源重组成功的噬菌体。
[0020]实施例6特异检测大肠杆菌0157工程噬菌体检测大肠杆菌0157
(I)将大肠杆菌0157接种到液体LB培养基中，37°C恒温水浴摇床200 rpm振荡培养，直到0D600约为0.2左右。
[0021](2)将菌液用生理盐水10倍梯度稀释，使菌密度为107、106、105、104、103、102、10、I CFU/ mL，用无菌的液体LB作为对照组，每个样品设置三个平行。
[0022](3)取I mL实验组和对照组加入到1.5 mL的离心管中，再加入100 μ L噬菌体悬浮液，37°C恒温水浴锅中孵育10 min。离心完全弃上清，离心条件设定为转速6000 rpm,温度4°C，时间10 min。沉淀用100 yL生理盐水重悬浮，37 °C恒温培养箱中静置10 min。
[0023](4)用荧光显微镜观察各样品中是否有荧光出现。
[0024]实验结果显示如图5所示:
在实验组中有绿色大肠杆菌0157出现，表明该工程噬菌体已经侵入到大肠杆菌0157中，并可以用荧光显微镜检测得到，灵敏度实验表明，其灵敏度可达14 CFU/ mL。
【主权项】
1.一种用于同源重组噬菌体几I的质粒，它是由下述方法制备的: 1)用引物:Pl:gcggggttaaagcggaaagtcaatP2:tcaacgcggtcaatagcac 以噬菌体JLl基因组DNA为模板进行PCR扩增获得其碱基序列如序列表I所示的噬菌体JLl衣壳蛋白基因； 2)将衣壳蛋白基因插入PMD18-T载体中； 3)将插入了衣壳蛋白基因的PMD18-T载体和序列表2所示的荧光蛋白基因，用BssSI酶切后，连接，得PMD18-T-衣壳蛋白基因-绿色荧光蛋白基因-衣壳蛋白基因质粒。
2.一种用于检测大肠杆菌0157的特异工程噬菌体，它是用下述方法制备的: 将权利要求1所述的一种用于同源重组噬菌体JLl的质粒转化至大肠杆菌0157感受态细胞中；接种到液体LB培养基中培养，加入噬菌体几1，孵育10 min后，用双层琼脂法铺板，筛选同源重组成功的噬菌体。
3.特异工程噬菌体及检测大肠杆菌0157的方法，将待检样品接种到液体LB培养基中，37°C恒温水浴摇床200 rpm振荡培养，直到0D600为0.2 ;加入权利要求2所述的一种用于检测大肠杆菌0157的特异工程噬菌体悬浮液，浸染，荧光显微镜观察样品中是否有荧光出现。
【专利摘要】本发明公开了特异工程噬菌体检测大肠杆菌O157的方法，采用一种用于同源重组噬菌体JL1的质粒，该质粒是由下述方法制备的：以噬菌体JL1基因组DNA为模板进行PCR扩增获得其碱基序列如序列表1所示的噬菌体JL1衣壳蛋白基因；将衣壳蛋白基因插入pMD18-T载体中；将插入了衣壳蛋白基因的pMD18-T载体和序列表2所示的荧光蛋白基因，用BssSI酶切后，连接，得pMD18-T-衣壳蛋白基因-绿色荧光蛋白基因-衣壳蛋白基因质粒。同源重组噬菌体JL1，用筛选同源重组成功的噬菌体，检出大肠杆菌O157特异性强，检出限可达104CFU/mL。
【IPC分类】G01N21-64, C12N7-01, C12N15-70, C12N15-66
【公开号】CN104561068
【申请号】CN201410830594
【发明人】刘金华, 史艳宇, 薜力刚, 孟日增, 卢春梅, 刘韬
【申请人】吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月27日