一种芽胞杆菌发酵高效联产聚-γ-谷氨酸和2,3-丁二醇的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种利用芽胞杆菌分批发酵来高效联产聚-Y -谷氨酸和2，3- 丁二醇的方法。
【背景技术】
[0002]聚-Y-谷氨酸(poly Y -glutamic acid, Y-PGA)是由L-和D-谷氨酸连接形成的同聚酰胺，是一种可经微生物合成的高分子胞外聚合物，平均相对分子量一般介于10-10000 kD之间。Y -PGA具有水溶性、高粘性、成膜性和保湿性等，且对人体和环境无毒害。因此，在医药制造、环境治理、轻工业及农业等领域具有广泛的应用前景。由于目前筛选到的微生物存在Y-PGA产率低、原料成本高昂等各种问题，工业化应用受到严重制约。如何降低发酵成本，或提高Y-PGA发酵过程的附加值，将有助于提高Y-PGA相关产品的竞争力。
[0003]2，3- 丁二醇作为一种重要的化工原料和液体燃料，广泛应用于化工能源及食品等领域，有广阔的工业应用前景，寻求经济高效和低污染的2，3-丁二醇制备方式并最终将其产业化一直是各国科学研究的热点。但是2，3-丁二醇对葡萄糖的理论得率仅为0.5 g/g左右，且目前高产2，3- 丁二醇的菌株大都是病原菌,如黏质沙雷氏菌、产气肠杆菌、克雷伯氏菌属等，而大规模工业化生产的安全性原则限制了这些生产菌株的应用。
[0004]经检索，现有报道技术仅单独生产聚-Y -谷氨酸或单独生产2，3- 丁二醇一种产品，存在原料利用率低、成本高等问题。本发明首次发现了一种利用芽胞杆菌同时高产聚-Y-谷氨酸和2，3- 丁二醇的新方法，可提高Y -PGA发酵过程的附加值，其中2，3- 丁二醇最高产量达73.68 g/L，发酵总产物对糖的得率达0.84 g/g，且所使用的地衣芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌为食品级安全微生物，具有工业化应用潜力。
【发明内容】
[0005]本发明是以提高Y-PGA发酵过程的附加值为目的，通过芽胞杆菌发酵联产聚-Y-谷氨酸和2，3- 丁二醇，同时生产聚-Y -谷氨酸和2，3- 丁二醇，具有广阔的工业化应用前景。
[0006]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
[0007]a、本发明的生产菌种采用冷冻保藏的地衣芽胞杆菌(地衣芽胞杆菌WX-02，于2008年4月28日送交中国湖北，武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO:M 208065)和枯草芽胞杆菌(枯草芽胞杆菌X-003，于2002年12月25日送交中国湖北，武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 202048)。
[0008]b、制备种子液:
[0009]将上述冷冻保藏的菌种在固体LB培养基平板上活化后，转接到液体LB培养基扩培，得到种子液。所述活化培养温度为37°C，培养时间12-24h ;所述扩培培养温度为37°C，摇床转速200r/min，培养8_12h ;所述固体LB培养基的配方为(g/L):蛋白胨10、酵母浸出物5、NaCllO、琼脂15，pH7.0 ;所述液体LB培养基的配方为(g/L):蛋白胨10、酵母浸出物5、NaCl10，ρΗ7.0。
[0010]C、分批发酵培养:
[0011](I)配制联产发酵培养基，其组成为(g/L):葡萄糖70-170，谷氨酸钠10-80，硝酸钠 0-15，K2HPO4.3Η200.5-2, MgSO4.7Η200.5-2, CaCl2.2Η200.05-1.5，ZnSO40.05-1.5，MnSO40.05-0.15，初始 pH 值为 7.0-7.5，初始 pH 为 7.0-7.5。
[0012](2)三角瓶按100mL/500mL的装液量加入培养基，115°C灭菌30min，接种量为3%，37°C培养30-60h ;发酵罐按50-80%的装液量加入发酵培养基，115°C灭菌30min，37°C培养30-60h，通气比 I:0.5-2 (V/V)。
[0013]其中葡萄糖的优选浓度为70_170g/L，谷氨酸钠的优选浓度为10_80g/L，硝酸钠的优选浓度为5-15g/L，优选发酵培养时间为30-60h。
[0014]本发明具有如下突出特点:
[0015]( I)本发明首次提出了聚1-谷氨酸和2，3- 丁二醇的高效联产方法，角度新颖，经济高效。
[0016](2)本发明通过食品安全级菌株来生产2，3- 丁二醇，为2，3- 丁二醇进一步的工业应用奠定了基础。
[0017](3)发酵培养基原料成本低，聚- Y-谷氨酸和2，3- 丁二醇联产产率增加显著。
【具体实施方式】
[0018]以下通过实施例对本发明进行详细说明，但所有实施例并不对本发明构成任何限制。
[0019]实施例1用地衣芽胞杆菌以发酵培养基I摇瓶发酵联产聚-Y -谷氨酸和2，3- 丁二醇
[0020](I)用冷冻保藏的菌种地衣芽胞杆菌WX-02 (CCTCC NO:M208065)为生产菌株。
[0021](2)斜面菌种活化:
[0022]将冷冻保藏的地衣芽胞杆菌WX-02，接种到LB固体斜面(含蛋白胨10g/L、酵母浸出物 5g/L、NaC110g/L、琼脂 15g/L、pH7.0)，37°C培养 24h，得到活化菌种。
[0023](3)种子液培养:
[0024]将LB固体斜面活化的种子菌转接到含蛋白胨10g/L，酵母浸出物5g/L，NaCllOg/L，pH为7.0的LB三角瓶液体种子培养基中，于37°C，200r/min下培养1h至对数生长中期。(4)摇瓶分批发酵培养:
[0025]上述发酵培养基I配制方法如下:葡萄糖90g/L，谷氨酸钠30g/L，柠檬酸钠1g/L，氯化铵 8g/L, MnSO4.H2O0.1 g/L, MgSO4.7Η201.5g/L, K2HPO4L 5g/L, ZnSO4.7H201.5g/L,CaCl2.2H201.5g/L，pH7.0，补充蒸馏水至1L，将所述的发酵培养基分装500mL的三角瓶，每瓶装液量lOOmL，115°C灭菌30min，冷却至37°C，按照1.5ml的接种量接入种子液，摇床转速200r/min,发酵温度37°C，发酵至36h结束发酵。
[0026](5)聚-Y-谷氨酸含量的测定:
[0027]将上述发酵液离心除去菌体、收集上清液，取5mL离心上清液，加3倍体积酒精沉淀聚- Y-谷氨酸，溶解产物，加等体积浓盐酸，密封于沸水浴中水解24h，水解后将水解液加lOmol/L的NaOH中和定容，经0.22u m的微孔滤膜过滤，测定聚-Y -谷氨酸的含量由高压液相色谱仪(HPLC)完成，色谱柱AgilentllOO，流动相为lOOmmol/L KH2PO4加5.0%甲醇(用磷酸调PH值至2.5)过滤，超声波除气，紫外检测波长为210nm，流速为lmL/min，谷氨酸作为定量的标准物。按照下列公示计算:聚-Y-谷氨酸浓度=水解后谷氨酸浓度X129/147。
[0028](6) 2，3- 丁二醇含量的检测:
[0029]取上述发酵液0.6mL加3mL乙酸乙酯(含lg/L的正丁醇为内标)，充分震荡，再加入2.17g无水硫酸镁干燥，充分混匀，静止抽提2h，离心取上清经0.22 μ m有机相微孔滤膜过滤，测定2，3- 丁二醇的含量由气相色谱仪完成,气相色谱仪Trace GC Ultra (Thermo公司)检测。气相色谱参数如下:氢火焰检测器，TR-WAX色谱柱(30mX0.32mm ID, 0.25um Film)，氮气做载气，流量为1.0mL/min，进样量I μ 1，不分流进样，进样器温度215°C，检测器温度245°C，柱温箱升温程序:50°C保持2min，以10°C /min升温至110°C保持0.5min,以5°C /min升温至150°C保持0.5min,以20°C /min升温至220°C保持Imin。
[0030]测定结果得到发酵液中聚-Y-谷氨酸的含量为12.5g/L，2，3_ 丁二醇的含量为46.21g/L。
[0031]实施例2用地衣芽胞杆菌以发酵培养基2摇瓶发酵联产聚-Y -谷氨酸和2，3- 丁二醇
[0032](I)本实施例采用的生产菌种同实施例1(1)。
[0033](2)斜面菌种活化同实施例1⑵。
[0034](3)种子液培养同实施例1 (3)。
[0035](4)摇瓶分批发酵培养:
[0036]上述发酵培养基2配制方法如下:葡萄糖90g/L，谷氨酸钠30g/L，硝酸钠1g/L,柠檬酸钠 10g/L，氯化铵 8g/L，MnSO4.H2O0.15g/L，MgSO41 g/L, K2HPO4.3H201g/L，ZnSO4.7Η201δ/?,0Β0121δΑ,ρΗ7.0，补充蒸馏水至1L，将所述的发酵培养基分装500mL的三角瓶，每瓶装液量lOOmL，115°C灭菌30min，冷却至37°C，按照1.5ml的接种量接入种子液，摇床转速200r/min,发酵温度37°C,发酵至48h结束发酵。
[0037](5)聚-Y-谷氨酸含量的测定同实施例1(5)。
[0038](6) 2，3- 丁二醇含量