一种海洋酶催化不对称还原制备手性叔亮氨酸的方法及酶的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种海洋酶催化三甲基丙酮酸立体选择性制备L-叔亮氨酸的方法。
【背景技术】
[0002] 手性氨基酸（天然L-氨基酸和非天然D-氨基酸）是合成手性药物、手性农药和 手性食品添加剂等精细化工品的关键中间体。许多新药（如蛋白酶抑制剂类、抗艾滋病药 等）的制备需要使用人工合成的非天然手性氨基酸。而众多手性氨基酸的合成离不开氧化 还原酶的催化，因此寻找高选择性的氧化还原酶成为手性氨基酸研宄的热点。
[0003] 叔亮氨酸是一种非蛋白原的手性氨基酸，广泛应用于抗艾滋病药物阿扎那韦和达 卢那韦、丙肝治疗药物特拉波维和博赛波维以及生物抑制剂等的合成。目前中国使用的抗 HIV药物全部为进口药，主要由默沙东与施贵宝两家公司生产，价格昂贵。美国药品及医 疗保健品市场调研公司Decision Resources称，中国的丙肝药物市场价值将从2010年的 1. 37亿美元增至2015年的2. 47亿美元。因此获得制备广泛用于抗艾滋病药、抗肿瘤药物 合成的L-叔亮氨酸的自主产权显得尤为重要。海洋微生物来源的脱氢酶将比陆地微生物 来源的脱氢酶在极端条件下更具优势，能在极端环境中保持较高的活性和较好的稳定性。 通过对海洋微生物及其氧化还原酶系的挖掘、催化机制研宄和改造，降低手性氨基酸的生 产成本很有必要。
[0004] Bommarius等报道了甲酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的偶联系统，利用甲酸脱氢酶为 亮氨酸脱氢酶提供必要的还原型辅酶NADH。该方法受到底物浓度低、辅酶投入量大以及生 产过程复杂导致成本过高等因素的制约。中国专利CN1934264也采用类似的全细胞催化 剂转化酮酸为L-叔亮氨酸，其优选的最大稳定底物浓度小于0. 4M，由于其产物浓度仍然 较低，不利于工业化生产。叔亮氨酸的制备方法通常有两种，即化学合成法和微生物发酵 法。化学合成法的收率较低；需使用剧毒的氰化物，污染环境；副反应较多；工艺路线长等 缺点。而微生物发酵法具有环境友好，节能绿色等优点，缺点是发酵产物浓度低，生产周期 长，工艺管理要求严格。全细胞催化 [1]三甲基丙酮酸不对称还原胺化获得手性叔亮氨酸， 具有反应路线简洁，易实现辅酶再生等优点。因此，筛选含有催化不对称还原胺化高活性高 选择性的亮氨酸脱氢酶是实现手性叔亮氨酸有效制备的关键。来源于海洋微生物的氧化还 原酶具有一些陆地酶所不具有的特性，如广泛的底物谱、耐盐性、耐有机溶剂等特性，使得 其受到更多的关注。
【发明内容】
[0005] 本发明从海洋微生物筛选获得含有依赖NADH的亮氨酸脱氢酶的不同以往报道的 新酶。本发明还考察了底物浓度、反应缓冲液、PH、温度等影响，优化了该酶所构建的工程菌 全细胞催化三甲基丙酮酸不对称还原胺化制备L-叔亮氨酸的反应体系和反应条件。
[0006] 本发明所述的工程菌全细胞催化三甲基丙酮酸不对称还原胺化制备L-叔亮氨 酸，是利用全细胞中亮氨酸脱氢酶的高度对映体选择性，催化三甲基丙酮酸的不对称还原 胺化，获得L-叔亮氨酸，葡萄糖等辅助底物加入用于辅酶NADH的循环再生。其以葡萄糖为 辅助底物的化学反应式如下：
[0007]
【主权项】
1. 一种海洋酶催化不对称还原制备手性叔亮氨酸的方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 基因组DNA的提取：将菌种接入2216L液体培养基中培养，抽提细菌基因组DNA ;所 述菌种为柴油食烧菌（Alcanivorax dieselolei)，该菌株保藏于中国海洋微生物菌种保藏 管理中心，保藏号为MCCC编号1A02288 ; 2) 基因克隆及工程菌的制备：以基因组DNA为模板扩增目的基因，并装载到pET28a载 体上，转入大肠杆菌DE3中即得到需要的工程菌； 3) 细胞液制备：将工程菌接入含卡那霉素的LB液体培养基中培养，培养结束获得的发 酵液，在冷冻离心机中离心获得细胞，用缓冲液重悬、洗涤，配置成细胞液； 4) 全细胞催化反应：在步骤3)的细胞液中，加入三甲基丙酮酸和氨基供体作为底物， 加入辅助底物用于辅酶循环再生，利用全细胞催化不对称还原胺化得到产物手性叔亮氨 酸。
2. 如权利要求1所述的海洋酶催化不对称还原制备手性叔亮氨酸的方法，其特征在 于在步骤1)中所述模板DNA制备方法为：所述的菌种接种量为1 %-10% ;所述2216L培 养基组成为l_15.0g/L蛋白胨，l-10.0g/L酵母粉，0. Ι-lg/L牛肉膏，0. l-2g/L柠檬酸 钠，0. 1-lg/L NH4NO3, 0. l-2g/L乙酸钠，用海水配置；所述的培养条件为：起始pH 6. 5-8. 0， 装液量体积分数为5% -15%，培养温度20-40°C，摇床转速150-250rpm，培养时间12-48h， Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒抽提总DNA。
3. 如权利要求1所述的海洋酶催化不对称还原制备手性叔亮氨酸的方法，其特征 在于在步骤2)中所述基因克隆及工程菌的制备方法为：以柴油食烷菌（Alcanivorax dieselolei)总DNA为模板，用引物F-Ad-Leu和R-Ad-Leu进行PCR扩增，得到如附录1 所示的亮氨酸脱氢酶基因序列，其中PCR反应体系为：22yL H20，lyL F-Ad-Leu，lyL R-Ad-Leu，1 μ L 总 DNA，25 μ L PrimeSTAR Max Premix ;PCR 反应条件为：94°C预变性 5min， 94°C变性 10s，54°C复性 10s，72°C延伸 6s，循环 30 次，72°C延伸 IOmin ;用 NdeI 和 HindIII 分别双酶切亮氨酸脱氢酶基因及pET28a质粒，用T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌E. coli DH5 α，然后提取质粒转化大肠杆菌E. coli BL21DE3构建亮氨酸脱氢酶基因的E. coli工程 菌。
4. 如权利要求1所述的海洋酶催化不对称还原制备手性叔亮氨酸的方法，其特征在于 在步骤3)中所述将细胞液制备方法为：所述的LB培养基的组成为：胰蛋白胨5. 0?15. Og/ L，酵母浸膏I. 0?10. Og/L，NaC15. 0?15. Og/L，调节pH7. 0?L 5,接种前添加卡那霉素 使其终浓度为50?150ug/mL ;所述培养条件为37°C，150?250rpm培养1. 5?3h后加入 诱导剂IPTG，使其终浓度为5?15mg/ml，继续在25?30°C，150?250rpm下培养4?6h。
5. 如权利要求1所述的海洋酶催化不对称还原制备手性叔亮氨酸的方法，其特征在 于在步骤4)中培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心，4°C，8000rpm，15min，获得细 胞，弃上清液，沉淀用pH 6. 5-8. 0的PBS缓冲液重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次，所述 的配置细胞液浓度为〇. 025?100g/L。
6. 如权利要求1所述的海洋酶催化不对称还原制备手性胺的方法，其特征在于在步骤 4)中，所述的氨基供体为：0· 002?lmol/L的氨水、NH4CKNH4NO3和甲酸铵。
7. 如权利要求1所述的海洋酶催化不对称还原制备手性胺的方法，其特征在于步骤4) 中，所述的辅助底物为〇. 001?lmol/L的葡萄糖、甘油、木糖、半乳糖、异丙醇中的一种或多 种。
8. 如权利要求1所述的所述的海洋酶催化不对称还原制备手性叔亮氨酸的方法，其特 征在于步骤4)中所述缓冲液为0. 01-0. 2mol/L的pH为7?13的NH4Cl-氨水，Tris-盐 酸、乙酸钠、碳酸钠、磷酸钾中的一种或几种。
9. 如权利要求1所述的海洋酶催化不对称还原制备手性叔亮氨酸的方法，其特征在于 步骤4)中所述的反应条件是pH 7?13,反应温度20°C?50°C下，震荡速率100_300rpm， 反应时间30?150小时。
10. -种用于催化不对称还原制备手性叔亮氨酸的海洋酶，其特征在于：编码该海洋 酶的DNA序列如SEQ ID NO 1所示。
【专利摘要】一种海洋酶催化不对称还原制备手性叔亮氨酸的方法及酶，属于生物法不对称合成手性化合物技术领域。本发明筛选得到亮氨酸脱氢酶来源于柴油食烷菌(Alcanivorax？dieselolei)，经过菌株培养，基因克隆，构建工程菌，细胞制备，在加入氨基供体和辅助底物情况下，细胞催化三甲基丙酮酸不对称还原胺化得到产物手性叔亮氨酸。本发明确定了基于该酶所构建工程菌的全细胞催化三甲基丙酮酸不对称还原胺化的反应体系和反应条件。本发明操作方便，设备简单，在生物催化制备手性叔亮氨酸领域具有较好的工业应用前景，对于今后生物催化专用酶源的开发和手性化合物合成方法的研究具有较为重要的意义。
【IPC分类】C12R1-19, C12P13-00, C12N9-04, C12P13-04, C12N1-21
【公开号】CN104561161
【申请号】CN201410803002
【发明人】方柏山, 江伟, 王世珍
【申请人】厦门大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月22日