一种高产洛伐他汀的生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高产洛伐他汀的生产方法及该生产方 法所用到的红曲菌。
【背景技术】
[0002] 洛伐他汀是一种能够抑制体内胆固醇合成的生理活性物质，自1987年美国Merck 公司将洛伐他汀系列开发推出新一代的降胆固醇药物以来，洛伐他汀作为新型的调整血脂 药，深受广大患者的欢迎。
[0003] 目前，洛伐他汀的生产菌株主要为土曲霉和红曲霉。土曲霉发酵产量高，但出于安 全考虑，土曲霉发酵物需经有机溶剂提取，或再进行化学合成等步骤，得到的为纯品闭环洛 伐他汀。这些是目前市场上医药类降脂药物的主要成分。闭环洛伐他汀本身无活性，需经人 体内的羟基酯酶水解，从而增加肝、肾负担，属美国处方药物管辖。而开环洛伐他汀可以被 人体直接利用，一般只有在天然发酵的红曲霉中能够得到。目前红曲霉的洛伐他汀产量较 低，但红曲霉发酵具有其独特的优势：其发酵产物中除了含有洛伐他汀之外，还有一系列洛 伐他汀结构类似物、Y -氨基丁酸等生理活性物质存在，这些相关成分和洛伐他汀相联合， 不仅具有协同调节血脂的功效，而且还极大地降低了纯品洛伐他汀的副作用。因此，以红曲 霉开发的保健食品、保健药品在国内、国际市场上都非常受欢迎。
[0004] 红曲霉的发酵工艺主要有两种，即固态发酵和液态发酵。目前红曲霉生产洛伐他 汀主要采用固态发酵的方式。固态发酵具有生产过程简单，投资少，产量高，后处理简单等 优点。固态发酵也有缺点，如周期较液态发酵长，条件不易控制，容易染菌等。在工业化固 态发酵时，培养基和培养条件对其产量和品质的影响很大，获得的产品品质参差不齐，已逐 渐失去市场竞争力。液态发酵法具有规模大，自动化程度高，人力成本低，生产过程易控制 等显著优点。但是，由于受到产量和生产成本的限制，液体发酵生产洛伐他汀的研究一直停 留在实验室水平，没有形成产业化规模。
[0005] 因此，通过诱变育种获得洛伐他汀产量更高的红曲霉菌株，并通过优化发酵条件 提高红曲霉的洛伐他汀的产量对推动红曲类降脂产品的发展具有举足轻重的作用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的之一高产洛伐他汀的生产方法，并提供能够有效提高洛伐他汀产量 的诱变菌株红曲霉。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 一种高产洛伐他汀的生产方法，包括下述步骤： a、菌种诱变：以生理盐水从初始菌株紫色红曲菌生长斜面上将孢子洗下，制得孢子悬 液，接种种子培养基，培养36 h左右，取菌悬液以无菌纱布过滤，以玻璃珠震荡打散至单孢 子悬液，收集单孢子悬液然备用； 在无菌试管内加入等体积的单孢子悬液和1%的氯化锂溶液，充分混合，放置3个小时， 最后用无菌磷酸缓冲液稀释100倍，终止反应； 吸取I mL经氯化锂处理过的孢子稀释液注入无菌小皿中，置于激光下照射。照射时间 为8-12min，激光波长：630-640 nm照射功率密度为15-18 mw/cm2; 将诱变处理后的菌液稀释后涂布PDA固体平板，26-32°C培养3-4 d ; 将长出的单菌落转接到固体PDA平板的一侧，26-32°C培养4-5 d后，在平板另一侧转 接构巢曲霉，26-32°C下进行对峙培养7-8 d; b、选取构巢曲霉菌落直径为3. 0-5. Ocm的红曲霉菌株，从平板上刮取红曲霉孢子转接 到种子培养基上，26-32°C培养2-5 d，按照12-16%的接种量，将长好的种子培养基转接到 发酵培养基中，26-32°C摇床120-180 r/m培养2-5 d后，20-25°C摇床120-180 r/m培养 18-25d。
[0008] 上述种子培养基包括米粉2-5g、碳源l-3g、氮源0. l-o. 5g、蛋白胨1.0-2. 0g、 MgSO4 · 7H20 0· 02-0. 08g、KH2PO4 0· 10-0. 20g，加水至 100 mL。
[0009] 优化的，上述碳源为葡萄糖、乳糖或木糖，所述氮源为NaN03。
[0010] 作为上述种子培养基的一种优化，上述种子培养基包括米粉3g、葡萄糖2g、NaNO3 〇· 2g、蛋白胨 I. 5g、MgSO4 · 7H20 0· 05g、KH2PO4 0· 15g，加水至 100 mL。
[0011] 上述发酵培养基包括米粉5-10 g、碳源1-5 mL、氮源0. l-o. 5 g、蛋白胨 1. 0-2. 0g、MgSO4 · 7H20 0· 02-0. 08g、KH2PO4 0· 10-0. 20g、加水至 100 mL。
[0012] 优化的，上述碳源为甘油或葡萄糖，所述氮源为NaN03。
[0013] 作为上述发酵培养基的一种优化,上述发酵培养基包括米粉7 g、甘油5mL、NaNO3 〇· 2 g、蛋白胨 I. 5g、MgSO4 · 7H20 0· 05g、KH2PO4 0· 15g、加水至 100 mL。
[0014] 优化的，上述的一种高产洛伐他汀的生产方法，包括下述步骤： a、 菌种诱变：以生理盐水从初始菌株Monascus purpureus紫色红曲菌生长斜面上将 孢子洗下，制得孢子悬液，接种种子培养基，培养36 h，取菌悬液以无菌纱布过滤，以玻璃珠 震荡打散至单孢子悬液，收集单孢子悬液然备用； 在无菌试管内加入等体积的单孢子悬液和1%的氯化锂溶液，充分混合，放置3个小时， 最后用无菌磷酸缓冲液稀释100倍，终止反应； 吸取I mL经氯化锂处理过的孢子稀释液注入无菌小皿中，置于激光下照射。照射时间 为lOmin，激光波长：632. 8nm照射功率密度为17. 6 mw/cm2; 将诱变处理后的菌液稀释涂布PDA固体平板，30°C培养3 d ; 将长出的单菌落转接到固体PDA平板的一侧，30°C培养4 d后，在平板另一侧转接构巢 曲霉，30°C下进行对峙培养8 d; b、 选取构巢曲霉菌落直径为3. 0-5. Ocm的红曲霉菌株，从平板上刮取红曲霉孢子转接 到种子培养基上，30°C培养3d，按照15%的接种量，将长好的种子培养基转接到发酵培养基 中，30°C摇床150r/m培养3 d后，24°C摇床150 r/m培养20d。
[0015] 上述的一种高产洛伐他汀的生产方法中，所述初始菌株紫色红曲菌Monascus sp.于2012年11月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保 藏编号为CGMCCNo. 6807,保藏单位地址为：北京市朝阳区大屯路。
[0016] 本发明的紫色红曲霉（Jfoftascw1S 具有以下形态特征： 于400倍显微镜观察紫色红曲霉的菌丝体形态，菌株形态特征为：菌丝体分枝甚繁、有 隔，直径3. O μ m-7. O μ m，幼时有内含物，分生孢子球形或洋梨形、无色，子囊果球形、无色、 短柄,椭圆形（5. 0-7. 0) μ mX (4. 5-5. 0) μ m。
[0017] 本发明的紫色红曲霉MPB3具有以下培养特征： 紫色红曲霉在PDA琼脂培养基中30°C培养7d，菌落较大，稍凸起，疏松，呈绒毡状，蔓 延性一般，正面中间浅粉色，背部深红色，菌落大小（3. 0-4. 0) cmX (4. 5-5. 5) cm，生长速度 较快； 紫色红曲霉MPB3在察氏琼脂培养基中30°C培养7d，菌落小，凸起最高，呈绒毡状，疏 松，蔓延性差，正面浅红色，背部红色，菌落大小（2. 5-3. 0) cmX (3. 5-4. 5) cm，生长速度较 慢。
[0018] 本发明的紫色红曲霉的生物学特性如下： 生长温度为20°C -38°C，最适生长温度为35°C -32°C，在pH2. 0-7. 0的范围内均能生 长。在察氏培养基和PDA琼脂培养基30°C培养7d，连续传代数代培养，其培养特征及形态 特征均无明显变化，该菌株的生物学性状基本稳定。
[0019] 本发明的有益效果是： 本发明的诱变菌株及其生产洛伐他汀的方法，与常规红曲霉生产菌株及生产方法相 t匕，其洛伐他汀产量可达到1650mg/L以上，洛伐他汀生产能力更高，提高了洛伐他汀的质 量。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明紫色红曲霉在PDA培养基平板上生长时菌落形态； 图2为本发明紫色红曲霉在在查氏培养基平板上生长时菌落形态。
【具体实施方式】
[0021] 以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明 的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发 明的保护范围之内。
[0022] 实施例1 高产洛伐他汀红曲霉菌株的诱变及初筛 以生理盐水从初始菌株Monascus purpureus紫色红曲菌生长斜面上将孢子洗下，制得 孢子悬液，接种种子培养基，培养36 h左右，取菌悬液以无菌纱布过滤，以玻璃珠震荡打散 至单孢子悬液，收集单孢子悬液备用。
[0023] 在无菌试管内加入等体积的单孢子悬液和1%的氯化锂溶液，充分混合，放置3个 小时，最后用无囷憐Ife缓冲液稀释100倍，终止反应。
[0024] 吸取I mL经氯化锂处理过的孢子稀释液注入无菌小皿中，置于激光下照射。照射 时间为10 min。激光波长：632. 8 nm照射功率密度为17. 6 mW/cm2。
[0025] 将经过诱变处理后的菌液稀释至适当浓度后涂布PDA固体平板，30°C培养3 d。将 长出的单菌落利用打孔器转接到固体PDA平板的一侧，30°C培养4 d后，利用打孔器在平板 另一侧转接构巢曲霉，30°C下进行对峙培养8 d后，通过比较构巢曲霉菌落直径来筛选洛伐 他汀高产的红曲霉菌株。
[0026] 实施例2 红曲霉液态发酵生产洛伐他汀 发酵菌株：Monascus purpureus紫色红曲菌 种子培养基： 米粉 3 g，葡萄糖 2 g，NaNO3 0.2 g，蛋白胨 1.5 g，MgSO4WH2O 0.05 g，KH2PO4 0. 15 g，加水至100 mL。
[0027] 发酵培养基： 米粉 7 g，甘油 5 mL，NaN03 0.2 g，蛋白胨 1.5 g，MgS04.7H20 0.05 g，KH2P04 0.15 g，加水至100 mL。
[0028] 培养条件： 从平板上刮取红曲霉孢子转接到装有50 mL种子培养基的三角瓶中，30°C培养3 d。按 照15%的接种量，将长好的种子培养基转接到150 mL发酵培养基中，30°C摇床150 r/m培 养3 d后，24°C摇床150 r/m培养20d. 样品