一种蓝莓花青素高效合成提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种蓝莓花青素高效合成提取方法，属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002]大量研究表明，膳食调节和营养补充可以改善人体健康和预防疾病。合理的营养疗法可以提高传统药物的治疗效果，减少药物使用量，从而减少药物治疗的副作用。近年来研究发现，蓝莓中富含大量天然的花青素，具有抗氧化能力，能够改善人体功能及预防某些眼科疾病。因此，如何高效的提取利用蓝莓中的花青素已成为21世纪新兴前沿的研究课题。
[0003]目前采用的分离提取技术得到的花青素:含量低、杂质多、医疗保健价值低。由于花青素对PH值、温度和光比较敏感，因此现有的超声技术、溶剂浸提法等分离纯化技术提取的花青素含量少、活性低，造成对人体保健，防病治病的效果降低。
[0004]蓝莓被世界卫生组织(World Health Organizat1n,WHO)誉为抗氧化活性最强的果蔬之一。这是因为蓝莓中富含类黄酮、酚酸等多酚类物质。蓝莓中的花青素被认为是蓝莓的主要生物活性。因此，提取高生物活性和含量的蓝莓花青素，保护人们富人身体健康、预防疾病具有重大意义。
【发明内容】
[0005]本发明目的是:针对蓝莓花青素主要集中在蓝莓细胞内，大量花青素前体未被充分合成利用，导致目标成分溶出难、活性成分损失大、耗能高、成本高的缺陷，提出一种培养蓝莓细胞合成花青素，建立提取率高、操作性强、成本低、条件温和的蓝莓花青素合成提取方法。
[0006]具体按以下步骤操作进行:
(1)原料预处理:取新鲜、无腐烂的蓝莓果实为原料，经清洗、机械捣碎至浆状后备用；
(2)蓝莓细胞培养:将步骤⑴中的蓝莓匀浆经0.7 mmol.Γ1 Triton X-100处理10-20 min，50~60Mpa的高流体静压(HHP)处理5 min后，接种:黑曲霉5_8%、红曲霉5_8%、地衣芽孢杆菌1_3%、粘红酵母4-7%，添加L-苯丙氨酸20~40 mg/L,酪氨酸3~8 mg/L,培养基配方:蔗糖0.3-0.5%，蛋白胨1.0-2.0%，葡萄糖0.3-0.5%，玉米浆1.0-3.0%，豆饼粉1.0-3.0%, NaCl 0.3-0.8%, K2HPO40.1-0.3%, pH 值 2.1-4.5，28-30° C 培养 5-8 天，收集培养液；
(3)提取混合物的分离与浓缩:将步骤(2)的发酵液至8000-10000r/min室温条件下离心10-20min，弃沉淀，收集上清液；将上清液进行超滤，压力为0.1-0.6MPa，温度25-40° C，收集浓缩液，得到花青素粗提液；
(4)分离、纯化:将步骤(3)的花青素粗提液置于AB-8吸附树脂层析柱中进行动态吸附，用4-6倍柱体积的去离子水洗涤柱子，除去水溶性杂质,再用30-50%乙醇洗脱液等浓度洗脱柱子，流速为2-4ml/min，得到纯度较高的花青素洗脱液； (5)干燥:旋转蒸发回收乙醇，真空冷冻干燥得纯度为96.34%的花青素粉末成品。
[0007]步骤(2)中，菌种可以选择黑曲霉6-7%、红曲霉6-7%、乳酸菌0.5-0.8%、地衣芽孢杆菌1.5-2.5%、粘红酵母5-6%、啤酒酵母1.0 -1.5%等微生物中的一种或几种的组合进行生物降解和合成。
[0008]步骤(2)中，培养基配方可以选择:蔗糖0.4-0.5%，蛋白胨1.2-1.8%，葡萄糖与玉米浆的添加的质量比为1:2。
[0009]步骤⑵中，L-苯丙氨酸与L-酪氨酸的添加质量比为1:1。
[0010]步骤(4)中，超滤采用截留分子量500Da的超滤装置。
[0011]本发明的优点在于:
1、与现有技术相比，本发明以蓝莓果实为原料，采用高流体静压-微生物发酵-超滤、柱层析等高新技术，提取果实中已含有的花青素。
[0012]2、利用黑曲霉和红曲霉和高流体静压破坏植物细胞壁，使花青素释放完全。
[0013]3、利用粘红酵母、乳酸菌产生苯丙氨酸酶，添加花青素前体物质L-苯丙氨酸与L-酪氨酸，利用蓝莓中原有的成分继续促进加速更多的天然花青素合成。
[0014]4、本发明技术低温、低pH值、避光，确保花青素化学性质稳定性，有机溶剂利用少易回收，生产周期仅为5-8天。
[0015]5、得到的花青素成品纯度大幅提高，可以达到99.31%。
[0016]6、本发明克服了传统生产中温度较高，溶出率较低，有机试剂用量多，成本高，效率低等缺点。因此本发明可实现规模化、产业化生产，增加蓝莓的经济价值，延长蓝莓产业链。
【具体实施方式】
[0017]实施例1
(1)原料预处理:取新鲜、无腐烂的蓝莓果实为原料，经清洗、机械捣碎至浆状后备用；
(2)蓝莓细胞培养:将步骤⑴中的蓝莓匀浆经0.7 mmol.Γ1 Triton X-1OO处理15-20 min, 55~58Mpa的高流体静压(HHP)处理3-4 min后，接种:黑曲霉6%、红曲霉6%、地衣芽孢杆菌1%、粘红酵母5%,添加L-苯丙氨酸30mg/L, L-酪氨酸5mg/L,添加L-苯丙氨酸与L-酪氨酸的添加的质量比为1: 1，培养基配方:葡萄糖0.4%，玉米浆1.5%，NaCl 0.4%，K2HPO40.2%，pH值2.5，28° C培养7天，收集培养液；
(3)提取混合物的分离与浓缩:将步骤(2)的发酵液至80000r/min室温条件下离心10-20min，弃沉淀，收集上清液；将上清液进行超滤，压力为0.1MPa，温度25° C，收集浓缩液，得到花青素粗提液；
(4)分离、纯化:将步骤(3)的花青素粗提液置于AB-8吸附树脂层析柱中进行动态吸附,用5-6倍柱体积的去离子水洗涤柱子，除去水溶性杂质,再用30-50%乙醇洗脱液等浓度洗脱柱子，流速为2-4ml/min，得到纯度较高的花青素洗脱液；
(5)干燥:旋转蒸发回收乙醇，真空冷冻干燥得纯度为98.27%的花青素粉末成品。
[0018]实施例2
(1)原料预处理:取新鲜、无腐烂的蓝莓果实为原料，经清洗、机械捣碎至浆状后备用；
(2)蓝莓细胞培养:将步骤⑴中的蓝莓匀浆经0.7 mmol.Γ1 Triton X-1OO处理15-20 min，55~58Mpa的高流体静压(HHP)处理3-4 min后，接种:红曲霉6%、乳酸菌0.6%、粘红酵母5%、啤酒酵母1.2%,添加L-苯丙氨酸30 mg/L, L-酪氨酸6 mg/L,添加L-苯丙氨酸与L-酪氨酸的添加的质量比为1: 1，培养基配方:蔗糖0.5%，玉米浆2.0%，NaCl 0.5%，K2HPO40.3%，pH值3.5，28。C培养7天，收集培养液；
(3)提取混合物的分离与浓缩:将步骤(2)的发酵液至9000r/min室温条件下离心15min，弃沉淀，收集上清液；将上清液进行超滤，压力为0.3MPa，温度30° C，收集浓缩液，得到花青素粗提液；
(4)分离、纯化:将步骤(3)的花青素粗提液置于AB-8吸附树脂层析柱中进行动态吸附,用5-6倍柱体积的去离子水洗涤柱子，除去水溶性杂质,再用30-50%乙醇洗脱液等浓度洗脱柱子，流速为3-4ml/min，得到纯度较高的花青素洗脱液；
(5)干燥:旋转蒸发回收乙醇，真空冷冻干燥得纯度为99.18%的花青素粉末成品。
[0019]实施例3
(1)原料预处理:取新鲜、无腐烂的蓝莓果实为原料，经清洗、机械捣碎至浆状后备用；
(2)蓝莓细胞培养:将步骤(I)中的蓝莓匀浆经0.7mmol.Γ1 Triton X-1OO处理10~15 min,55~58Mpa的高流体静压(HHP)处理3-4 min后，接种:红曲霉7%、乳酸菌
0.8%、粘红酵母6%、啤酒酵母.5%，添加L-苯丙氨酸与L-酪氨酸的添加的质量比为1:1，培养基配方:蔗糖0.5%，蛋白胨11.8%，葡萄糖与玉米浆的添加的质量比为1:2，NaCl 0.6%，K2HPO40.3%，pH值3.0，28-30° C培养7天，收集培养液；
(3)提取混合物的分离与浓缩:将步骤(2)的发酵液至lOOOOr/min室温条件下离心15min，弃沉淀，收集上清液；将上清液进行超滤，压力为0.5MPa，温度40° C，收集浓缩液，得到花青素粗提液；
(4)分离、纯化:将步骤(3)的花青素粗提液置于AB-8吸附树脂层析柱中进行动态吸附，用4-6倍柱体积的去离子水洗涤柱子，除去水溶性杂质,再用45-50%乙醇洗脱液等浓度洗脱柱子，流速为3.5-4ml/min，得到纯度较高的花青素洗脱液；
(5)干燥:旋转蒸发回收乙醇，真空冷冻干燥得纯度为99.31%的花青素粉末成品。
【主权项】
1.一种蓝莓花青素高效合成提取方法，其特征在于按以下步骤操作进行:(I)原料预处理:取新鲜、无腐烂的蓝莓果实为原料，经清洗、机械捣碎至浆状后备用；(2)蓝莓细胞培养:将步骤(I)中得到的蓝莓浆经0.7 mmol.!/1 Triton X-100处理10~20 min，50~60MPa的高流体静压处理5 min后，接种:黑曲霉5_8%、红曲霉5_8%、乳酸菌0.3-1.0%、地衣芽孢杆菌1_3%、粘红酵母4-7%、啤酒酵母0.6-1.5%，添加L-苯丙氨酸20~40 mg/L,L-酪氨酸3-8 mg/L,培养基配方:蔗糖0.3-0.5%，蛋白胨1.0-2.0%，葡萄糖0.3-0.5%，玉米浆 1.0-3.0%,豆饼粉 1.0-3.0%, NaCl 0.3-0.8%, K2HPO4 0.1-0.3%, pH 值 2.1-4.5，28-30° C培养5~8天，收集培养液，上述百分比浓度为质量百分比浓度，L-苯丙氨酸与L-酪氨酸的添加质量比为1:1 ; (3)提取混合物的分离与浓缩:将步骤(2)的培养液至8000-10000r/min室温条件下离心10_20min，弃沉淀，收集上清液；在压力为0.1-0.6MPa，温度25-40° C下，将上清液进行超滤，收集滤液，得到花青素粗提液；(4)分离、纯化:将步骤(3)得到的花青素粗提液置于AB-8吸附树脂层析柱中进行动态吸附，用4-6倍柱体积的去离子水洗涤柱子，除去水溶性杂质，再用30-50%乙醇洗脱液等浓度洗脱柱子，流速为2-4ml/min，得到纯度较高的花青素洗脱液；(5)干燥:旋转蒸发回收乙醇，真空冷冻干燥得质量纯度为96.34%的花青素粉末成品。
2.根据权利要求1所述的蓝莓花青素高效合成提取方法，其特征在于步骤(2)中，菌种选择黑曲霉6-7%、红曲霉6-7%、乳酸菌0.5-0.8%、地衣芽孢杆菌1.5-2.5%、粘红酵母5_6%、啤酒酵母1.0 -1.5%等微生物中的一种或几种的组合进行生物降解和合成。
3.根据权利要求1所述的蓝莓花青素高效合成提取方法，其特征在于步骤(2)中，培养基配方:蔗糖0.4-0.5%，蛋白胨1.2-1.8%，葡萄糖与玉米浆的添加的质量比为1:2。
4.根据权利要求1所述的蓝莓花青素高效合成提取方法，其特征在于步骤(4)中，超滤采用截留分子量500Da的超滤装置。
【专利摘要】本发明公开了一种高效合成提取蓝莓中花青素的方法，具体为蓝莓花青素合成提取制备技术。采用高流体静压辅助微生物发酵培养蓝莓细胞，超滤层析提取蓝莓中花青素。利用高流体静压辅助微生物代谢产物对蓝莓果实细胞壁破坏，使花青素充分释放；同时添加L苯丙氨酸和粘红酵母等产酶促进蓝莓中未转化成花青素前体合成花青素。发酵液经离心、超滤分离、层析纯化、真空冷冻干燥等处理，获得纯度为99.31%的花青素，增加花青素提取量的15%-30%。发明操作简单、生成过程清洁无害、成低、花青素得率大、纯度高，不需要人体肠道微生物降解，医疗保健价值高，适合规模化生产应用，具有极大的市场前景。
【IPC分类】C12P39-00, C12R1-685, C12P17-06, C12R1-66, C12R1-865, C12R1-10
【公开号】CN104561223
【申请号】CN201510037796
【发明人】叶澄
【申请人】温州泓呈祥科技有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月26日