用于检测靶核酸的引物和其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及在样品中检测靶核酸的方法。更具体地说，本发明涉及使用聚合酶和 荧光探针在样品中检测目标核酸的引物和其应用。
【背景技术】
[0002] 在分子诊断学领域中，使用核酸扩增反应对微生物核酸进行检测和量化发挥重要 的作用。针对各种病毒或细菌的常规检测是核酸扩增和检测反应大规模应用的一个例子。 核酸扩增反应，例如聚合酶链式反应（PCR)的方法是本领域已知的。然而，常规的PCR检测 方式存在需要对样品容器进行开盖取样，造成扩增反应环境的污染和导致测试结果的假阳 性的缺陷。
[0003] 使用荧光探针监测核酸扩增反应的方法是本领域已知的。基于PCR的分析的自动 化系统可利用PCR过程期间对产物扩增给出的荧光信号进行实时检测。这类方法的关键是 使用携带报告基团或标记物的经修饰的寡核苷酸。
[0004] 荧光探针的一个实例是双标记探针，一般由两种不同染料，也就是报道分子和猝 灭剂标记的寡核苷酸组成，能与特定的目标核酸序列杂交。报道分子是被光激发时能够发 射荧光的分子，而猝灭剂是能够吸收报道分子发射的荧光的分子。PCR反应的监测基于当 PCR反应进行时监测荧光随时间的强度。现在最常用的荧光检测利用的是荧光共振能量转 移（FRET)，这是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转 移到受体激发态的过程。在这种情况下，当报道分子被适当波长的光激发时，报道分子发射 的荧光被猝灭剂"猝灭"而观察到相对低的荧光强度。如果在PCR的延伸阶段期间探针被 DNA聚合酶裂解，报道分子与探针隔断，这样在报道分子和猝灭剂之间没有FRET发生。监测 荧光强度的变化可以用来定量地监测PCR反应。
[0005] 然而，现有的荧光双标记探针的使用存在相关的缺陷。例如需要使用大量昂贵的 荧光标记的寡核苷酸(包括引物和/或探针)，引物和/或探针设计复杂。
[0006] 因此，本领域还需要一种更方便，精确度更高，而且能够尽量避免假阳性问题的 PCR检测方法。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了一种扩增、检测和定量靶核酸的方法，其包括以下步骤：
[0008] (a)将样品在聚合酶的存在下与一对引物接触，所述引物与靶核酸的序列可特异 性杂交，其中所述聚合酶为具有3'_5'外切活性的聚合酶，并且所述一对引物中的至少一个 为报告引物，其特征在于：所述报告引物的3'和5'端分别标记了报告基团或淬灭基团，所 述报告基团的信号被淬灭基团淬灭，并且所述报告引物的3'端的一个或以上核苷酸与靶核 酸的序列错配，所述报告基团标记在错配的核苷酸上；
[0009] (b)实施一个或多个循环扩增步骤，其中循环步骤包括杂交步骤和核酸延长步骤， 所述杂交步骤包括使由所述引物与靶核酸特异性杂交，所述核酸延长步骤包括在所述聚合 酶的催化下，引物延伸和生成自所述靶核酸衍生的扩增产物；
[0010] (c)测量报告基因的信号，由此对靶核酸进行检测和定量。
[0011] 在本发明的方法中，所述报告引物在完整的情况下，例如游离在反应溶液中，或是 虽然与靶核酸模板杂交和结合，但是未被聚合酶的外切活性将标记了报告基团或淬灭基团 的碱基切除的情况下，报告基团或淬灭基团之间发生能量转移，使得从报告染料的荧光发 射至少部分或完全淬灭。
[0012] 在步骤（b)中，当靶核酸为双链DNA时，循环步骤还可包括杂交步骤前的变性步 骤，其中双链DNA模板退火，变成单链，由此引物可与模板上的靶序列特异性杂交。
[0013] 在步骤（b)中，所述聚合酶的催化作用包括在模板和与模板杂交的引物的存在 (引物提供3'-0H)的条件下，识别碱基和按5' 一3'的方向合成和延伸核酸，当所述聚合 酶识别到碱基存在不配对时，由于聚合酶的3' -5'外切活性，3'端错配的碱基被水解。
[0014] 当样品中存在靶核酸时，在步骤（b)中，报告引物与靶核酸发生特异性杂交，在聚 合酶的作用下延伸，同时，由于聚合酶的3' -5'外切活性，3'端错配的碱基被水解，标记在 所述错配的碱基上的报告基团脱落和离开淬灭基团；如果样品中不存在靶核酸，所述报告 基团的信号被淬灭基团淬灭，检测不到荧光信号；用光源激发报道分子；测量将报告引物 与靶核酸杂交和延伸的条件下获得的荧光，或者将其与在对照核酸存在的条件下获得的荧 光比较。
[0015] 在本发明中，有关术语具有现有的生物技术、有机化学、无机化学等领域的常规 定义。具体的，有关术语可如如下说明和定义。
[0016] 术语〃样品〃指的是包含或推测包含核酸的任何物质。例如从个体分离的组织或 液体样品，包括但不限于，例如，皮肤、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿、泪液、血细胞、 器官、肿瘤，以及体外细胞培养组分样品。
[0017] 术语〃核酸〃、〃多核苷酸〃和〃寡核苷酸〃可互换地使用。这些术语仅仅涉及核 酸分子的一级结构。〃核酸"、〃多核苷酸〃和〃寡核苷酸〃可以为双链和单链DNA，以及双 链和单链RNA。寡核苷酸一般具有至少大约6个核苷酸的序列，例如至少大约10-12个核苷 酸，或至少大约15-20个核苷酸。〃相应〃表示与指定序列一致或互补。寡核苷酸可以是来 自天然的，也可以是合成的，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。
[0018] 术语"聚合酶"是指催化核苷酸的聚合（即聚合酶活性）的酶，一般是指DNA聚合 酶。通常，该酶将在退火至多核苷酸模板序列的引物的3'-端开始合成，并将继续朝向模板 链的5'端。"DNA聚合酶"可催化脱氧核苷酸的聚合。
[0019] 术语〃引物〃一般指的是在具有催化与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件 (例如具有聚合酶和互补序列的模板，以及在合适的温度）下能够作为沿着互补链合成的起 始点的寡核苷酸。在聚合反应体系中，引物可以为一条或多条。术语"引物对"表示一组或 一对引物，其包括与扩增的核酸序列的5'末端的互补序列杂交的5'有义引物（有时称为 "正向"或"上游"）以及与扩增的序列的3'末端杂交的3'反义引物（有时称为"反向"或 "下游"）。
[0020] 术语"碱基配对"或〃互补〃是指公知的Watson-Crick碱基配对，包括双链DNA 中碱基对腺嘌呤-胸腺嘧啶和鸟嘌呤-胞嘧啶之间，或者RNA/DNA杂交分子中腺嘌呤-尿 嘧啶和鸟嘌呤-胞嘧啶之间的配对，以及非常规核苷酸或衍生物之间的类似组合。术语核 酸序列的互补物指的是当与核酸序列对应以便一条序列的5'末端与另一条的3'末端配 对时处于〃反向平行结合〃的寡核苷酸。例如，序列5' -AGTTC-3'与序列5' -GAACT-3'是 互补的。术语〃完全互补的〃或〃100%互补的〃等指的是在反向平行链之间具有完美的 Watson-Crick碱基配对(在多核苷酸双螺旋中没有错配）的互补序列。然而，互补有时不 是完全的，例如可以包含错配碱基对或不匹配碱基。术语〃部分互补〃、〃部分互补的〃、〃 非完全互补〃或〃非完全互补的〃等指的是反向平行多核苷酸链之间的任何碱基比对小 于100%完全的(例如，在多核苷酸双螺旋中存在至少一个错配或不匹配碱基)，但仍能形成 比较稳定的双链结构的情况。例如，反向平行多核苷酸链之间的碱基比对可以是至少99%、 95%、90%，或之间的任何值。
[0021] 术语〃靶核酸"、〃靶序列〃或〃靶核酸序列〃指