用于细胞凋亡调解子基因(bim)缺失突变的检测方法及其检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属分子生物学和医学领域，涉及细胞凋亡调解子基因（BM)缺失突变的检 测方法及其检测试剂盒，具体涉及一种用于检测BIM基因第三、第四外显子之间的内含子 上2903bp缺失突变的检测方法及其检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 现有技术公开了 BIM基因是编码细胞凋亡基因 BCL2蛋白家族中的一个成员， 在细胞凋亡中发挥重要的调节作用。研究表明BIM基因外显子3和外显子4之间存在的 2903bp的缺失会造成BM亚型BH3结构缺乏表达。而这种缺乏表达会导致肺癌病人对部分 治疗药物有更强的耐药性。有研究表明，在癌症病人体内，这种删除与药物反应的持续时间 相关联，并且能够被用来预测病人在没有疾病恶化时的存活时间，如携带这种删除突变的 患者的平均无疾病恶化存活期限为大约6个半月时间，而没有这种突变的患者则为12个月 左右。因此，业内认为BM缺失的检测对于肺癌患者有相当重要的现实意义。
[0003] 目前，临床实践中对BIM基因突变检测的方法主要包括：电泳、测序、变性高效液 相色谱（DHPLC)、荧光定量PCR法、基因芯片、液相芯片等方法。其中，测序法由于可以读到 DNA每个碱基的变化，目前被认为是检测基因突变的金标准方法，但因为该方法存在灵敏 度低的缺陷，检测异质性较高的临床肿瘤组织样本时假阴性率高，同时，还存在测序步骤繁 琐、耗时长，对设备和操作人员要求较高等缺陷，因此，不易形成标准化操作的临床诊断产 品。另外，DHPLC、基因芯片、液相芯片等方法也存在操作复杂，对设备要求高等缺陷，因此， 目前仅应用用科研单位实验室。
[0004] 综上所述，为了临床最终实现治疗肺癌的目标，本领域迫切需要寻求简单易行，快 速1?效的检测肺癌相关基因的方法、试剂盒，以及相关治疗药物。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种检测(包括早期诊断）BIM基因缺 失情况的方法及其检测试剂盒。具体涉及一种检测细胞凋亡调解子基因（BIM)缺失突变的 方法及其检测试剂盒，尤其是检测BM基因上第三、第四外显子之间内含子上2903bp缺失 突变的方法及其检测试剂盒。
[0006] 本发明方法简单易行，快速高效，成本低廉。
[0007] 本发明的一种检测BM基因缺失情况的方法，具体即检测BM基因第三、第四外 显子之间的内含子上2903bp缺失突变情况，缺失型个体相对普通人群对某些药物的耐药 性更高。
[0008] 本发明所述的2903bp缺失，位于BM基因第三、第四外显子之间的内含子上(脱氧 核糖核酸（DNA)序列编号：2903bp缺失位置基于SEQ ID N0:l/5、l/6,上游引物基于SEQ ID N0:2/5、2/6 ;下游引物1基于SEQ ID :3/5 ;下游引物2基于SEQ ID :4/6 ;扩增产物基于SEQ ID :5/6、6/6。
[0009] 具体而言，本发明的检测细胞凋亡调解子基因（BM)缺失突变的方法，其包括步 骤：
[0010] (a)抽提样品的基因组DNA，扩增获得BM基因第三、第四外显子之间的内含子上 包括2903bp缺失在内的产物；
[0011] (b)检测步骤（a)产物中2903bp缺失情况。
[0012] 本发明中，所述的扩增BM基因第三、第四外显子之间的内含子上2903bp缺失的 引物序列如SEQ ID N02和SEQ ID N03所示。
[0013] 上述方法中涉及的扩增、抽提基因组DNA等技术均可采用本领域的常规操作方 法。
[0014] 本发明还提供了检测BM基因缺失情况的检测试剂盒，它含有与BM基因第三、第 四外显子之间的内含子上2903bp缺失区域结合的探针，所述试剂盒还可以包括特异性扩 增BM基因第三、第四外显子之间的内含子上2903bp缺失区域的引物；在本发明的一个实 施例中，与特异性扩增BIM基因第三、第四外显子之间的内含子上2903bp缺失区域的引物 的序列如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。
[0015] 本发明中，检测BM基因缺失情况，即检测BM基因第三、第四外显子之间的内含 子上2903bp缺失突变情况，相关研究表明缺失型个体相对普通人群对某些药物的耐药性 更商；
[0016] 本发明的方法中，包括检测某个体的BIM缺失情况的步骤，以此判断某个体是否 存在有耐药可能性高于普通人群的差异。
[0017] 在本发明的一优选例中，所述的差异是选自2903bp的缺失情况，2903bp的缺失位 于BM基因第三、第四外显子之间的内含子上，其中脱氧核糖核酸（DNA)序列编号：2903bp 缺失位置基于SEQ ID NO 1/6。
[0018] 更进一步的，本发明提供了检测样品中是否存在BM基因第三、第四外显子之间 的内含子上2903bp缺失的方法，其包括步骤 ：
[0019] (a)用BM缺失检测特异性引物扩增样品的基因组DNA，得到扩增产物；和
[0020] (b)检测扩增产物中缺失情况。
[0021] 本发明所述的BM基因的详细序列可登见美国国立生物技术信息中心（NCBI)(可 参见网址 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)
[0022] 本发明中，对肺癌病例和正常对照人群进行了 BIM缺失情况实验检测，结果表明 本发明方法简单易行，快速高效，成本低廉。为BIM基因缺失检测提供了一个简捷的新途 径。
[0023] 本发明的一种用于细胞凋亡调解子基因（BIM)缺失突变的快速检测方法其优点 有：
[0024] 1、通量更高：相比传统的PCR而言，本发明使用R〇che480实时荧光定量系统，通量 更商；
[0025] 2、速度更快：传统的方法需要扩增几千bp的片段，另需要进行电泳鉴定扩增片 段，实验时间预计在5个小时以上，而本发明的方法只需要扩增100个bp左右的片段，所有 实验在2个小时内即可完成；
[0026] 3、结果更直观：传统的结果需要进行电泳分析，耗时耗力，而本方法只需要在实时 PCR结束后进行分析即可获得结果；
[0027] 4、结果更准确：众所周知，检测过程中，每开盖一次便增加一次污染的可能性，相 较传统检测需要开盖后进行电泳而言，本方法无需开盖，将污染可能性降到最小的程度。
【附图说明】
[0028] 图1为本发明的一个实施方式的样本中含有BIM基因2903bp纯合缺失的熔解曲 线分析图。
[0029] 图2为本发明的一个实施方式的样本中含有BIM基因2903bp杂合缺失的熔解曲 线分析图。
[0030] 图3为本发明的一个实施方式的样本中不含有BIM基因2903bp缺失的熔解曲线 分析图。 图4为本发明的一个实施方式的样本中含有BM基因2903bp纯合缺失、杂合缺失以及 不含有BIM基因2903bp缺失的PCR产物琼脂糖电泳图。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合【具体实施方式】和实验详细说明本发明的特征，但是，可以理解的是，说明 书的【具体实施方式】仅仅用于对本发明进行说明，并不能被解释为对本发明的限制。下列实 施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆；实验 室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照 制造厂商所建议的条件。
[0032] 实施例1实时荧光PCR检测
[0033] (一 )、实验材料
[0034] LightCycler? 480II荧光定量PCR仪购自瑞士 Roche公司，聚合酶链式反应液 (FastStart Universal SYBR Green Master)购自瑞士 Roche 公司。
[0035] (二)、引物设计与合成：
[0036] 以BIM基因的部分序列为模板，使用Primer Premier5软件分析设计引物，并由生 工生物合成。
[0037] 检测用引物：
[0038] BM基因缺失检测上游引物序列：
[0039] 5, -ATACCATCCAGCTCTGTCTTCATAG-3'（SEQ ID NO 2)
[0040] BIM基因缺失检测下游引物 1 序列：5'-CCCAACCTCTGACAAGTGACC'（SEQ ID NO 3)。
[0041] BIM 基因缺失检测下游引物 2 序列：5' -TTGGTGGGAATGTAAAATGGC-3'（SEQ ID NO 4)。
[0042] (三)、样本检测：
[0043] 实验共检测30例肺癌病例和30例正常对照人群，每例收集血样标本约2mL，用浓 盐法抽提基因组DNA，抽提结果用Nanodrop (Thermo公司）检测，
[0044] 按如下体系进行突光PCR扩增，后用LightCycler? 480II突光定量系统进行溶解 曲线分析：
[0045]
【主权项】
1. 一种用于细胞凋亡调解子基因缺失突变的检测方法，其特征在于，检测BIM基因第 三、第四外显子之间内含子上2903bp缺失情况；该方法包括步骤： (a) 抽提样品的基因组DNA，扩增获得BM基因第三、第四外显子之间的内含子上包含 2903bp缺失的区域； (b) 检测步骤（a)产物中BM基因的缺失情况。
2. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的2903bp缺失位于BM基因第三、 第四外显子之间的内含子上。
3. 如权利要求1所述的检测方法，其特在于，扩增BIM基因第三、第四外显子之间的内 含子上包含2903bp缺失的区域的引物序列如SEQ ID N02、SEQ ID N03和SEQ ID N04所 /Jn 〇
4. 如权利要求1所述的检测方法，其特在于，该方法中还包括特异性扩增BIM基因第 三、第四外显子之间的内含子上包含2903bp缺失区域的引物。
5. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，它含有与BIM基因第三、第四外显子之间 的内含子上2903bp缺失区域结合的探针，还包括特异性扩增BIM基因第三、第四外显子之 间的内含子上2903bp缺失区域的引物；与特异性扩增BM基因第三、第四外显子之间的内 含子上2903bp缺失区域的引物的序列如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。
【专利摘要】本发明属分子生物学和医学领域，涉及一种检测细胞凋亡调解子基因(BIM)缺失突变的方法及其检测试剂盒，本发明提供了一种检测细胞凋亡调解子基因(BIM)缺失突变的方法，它包括检测BIM基因上第三、第四外显子之间内含子上2903bp缺失的检测。本发明还公开了相应的检测试剂盒，该试剂盒还含有扩增BIM上2903bp缺失区域的引物。利用本发明检测BIM缺失情况，方法简单易行，快速高效，成本低廉。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104561251
【申请号】CN201310513126
【发明人】韩宝惠, 夏金晶, 邵敏华, 黄迅威
【申请人】上海市胸科医院
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月25日