鸡肠炎沙门氏菌感染甲基化调控基因的鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物基因工程技术领域，尤其涉及一种鸡肠炎沙门氏菌感染甲基化调 控基因的鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis)为革兰氏阴性菌，是一种危害较大的食 源性致病菌，感染家禽后，为家禽生产和人类健康带来严重的经济损失和安全隐患。
[0003] DNA的甲基化是真核生物主要的表观遗传修饰，是表观遗传学的重要组成部分，在 维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤及相关疾病发生中起着重要作用，异 常甲基化的发生是导致疾病的一大关键因素。启动子区域CpG岛（CGI)高甲基化导致免疫 基因表达失活是目前疾病研宄中的热点课题。
[0004] 目前，有人比较了不同鸡种生长快慢之间的甲基化差异，或利用MEDIP技术分析 了在感染致病型大肠杆菌后鸡脾脏全基因组甲基化变化和表达的关系，微生物在感染哺乳 动物后能够通过引起基因的高甲基化而引发各种疾病，而关于肠炎沙门氏菌感染对鸡全基 因组甲基化水平影响的报道较少，且尚无关于鉴定在肠炎沙门氏菌感染中发挥甲基化调控 基因的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的实施例提供一种鸡肠炎沙门氏菌感染甲基化调控基因的鉴定方法，可以 鉴定在鸡肠炎沙门氏菌感染中发挥甲基化调控作用的基因。
[0006] 为达到上述目的，本发明的实施例采用如下技术方案：
[0007] 一种鸡肠炎沙门氏菌感染甲基化调控基因的鉴定方法，其特征在于，包括以下步 骤：
[0008] S1、选择2日龄沙门氏菌阴性鸡，均分为试验组和对照组；所述试验组通过口腔灌 服法接种0. 3ml肠炎沙门氏菌，接种量为2-4X IO8Cfu/只，所述对照组接种0. 3mL的磷酸 盐缓冲溶液；
[0009] S2、接种14天后，根据感染肠炎沙门氏菌的盲肠内容物细菌含量结果，选择实验 组中细菌含量最多的个体3-6个；随机选择对照组中等数量的个体；被选中的每只鸡的脾 脏作为一个样本；
[0010] S3、从各个样本中提取DNA，实验组和对照组各构建2个DNA混池，利用DNA的破碎 试剂盒将各个DNA混池中的DNA打断至150-800bp的大小不等DNA片段，用T4DNA聚合酶 和Klenow酶将得到的所有DNA片段修饰成平末端；
[0011] S4、用Agencourt公司的产品AMPure XP磁珠筛选300_400bp的修饰成平末端的 DNA片段并纯化；
[0012] S5、在筛选出的DNA片段的平末端序列末端加腺嘌呤变成粘性末端；
[0013] S6、将筛选出的DNA片段与接头序列连接，采用甲基化DNA沉淀试剂盒对连接完成 后的序列样品进行甲基化的DNA富集，验证扩增纯化后进行测序以确定甲基化发生差异的 具体基因；
[0014] S7、进行数据分析，获得MeDIP-Seq数据产出统计表，如表1所示，从整体水平表示 了从样品中收集到全基因组参与测序的独有数据情况，且数据比对到基因组的比例较高， 说明数据质量来源可靠，可以进一步分析；图1表示的是每条染色体上DMR所占的百分比， 横坐标表示每条染色体（chr)，纵坐标指甲基化差异区域占每条染色体总长的比例，此图能 总体简略看出甲基化在整个基因组中所占的比例，除16、21和25号染色体外，DMR在各染 色体均有分布，比例较高的是10、11和24号染色体；在表2里，展示了 DMR在各个区域的分 布情况，通过表2,我们了解到甲基化是发生在包括内含子在内的整个基因组，并非只在转 录基因体现，说明甲基化在表观遗传现象起到的作用是通过多个基因位置实现的，如DNA， RNA ;图2表示的是甲基化差异显著基因的基因本体论功能分析，在这个表中，我们对差异 基因的功能进行聚类分析，全面了解甲基化差异的基因在感染中发挥的作用，筛选出在多 个功能类别中存在频率较高的基因，用于进一步鉴定感染中发挥重要作用的基因；表3是 对差异基因的信号通路分析，信号通路是指响应某一信息源而执行一定功能的通路，基因 在信号通路中发挥各自的作用，参与生物功能代谢等，也作为鉴定基因功能的因素之一；表 4是显著差异基因甲基化的倍数变化，表中直观展示了差异上调和下调倍数较大的前22个 基因，是筛选基因的主要依据；表5是将所有的差异基因进行本体论分析后，将其所包含的 全部基因重复数进行统计后得到的结果，对功能的分析和基因的鉴定有重要的参考价值。
[0015] S8、通过对甲基化差异基因的鉴定和对基因的功能和信号通路分析，结合差异基 因的甲基化倍数变化，鉴定得出肠炎沙门氏菌感染中发挥甲基化调控的基因。
[0016] 上述技术方案提供的方法中，脾脏是重要的免疫器官，利用鸡脾脏组织样品为试 验材料，利用上述测序鉴定在鸡肠炎沙门氏菌感染中的甲基化差异基因，将会为我们进一 步探讨甲基化在肠炎沙门氏菌感染中的调控作用以及筛选鸡抗沙门氏菌感染的分子标记 奠定基础。
【附图说明】
[0017] 图1为各染色体上DMR占每条染色体的百分比图示；
[0018] 图2为甲基化差异显著基因的基因本体论功能分析图示。
【具体实施方式】
[0019] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0020] 本发明的实施例提供一种鸡肠炎沙门氏菌感染甲基化调控基因的鉴定方法，如图 1所示，所述方法包括以下步骤：
[0021] S1、选择2日龄沙门氏菌阴性寿光鸡，均分为试验组和对照组；所述试验组通过口 腔灌服法接种0. 3mL肠炎沙门氏菌菌液2-4 X IOScfu/只，菌液稀释液为磷酸盐缓冲溶液， 所述对照组接种0. 3mL的磷酸盐缓冲溶液，对照组的设立，使试验结果的差异仅为肠炎沙 门氏菌感染的影响，较好的平衡和抵消了无关变量的影响，使试验结果更具有说服力。
[0022] 首先，选择1日龄山东寿光鸡，利用平板试验法检测并筛选沙门氏菌阴性个体，获 得2日龄沙门氏菌阴性寿光鸡。
[0023] S2、接种后14天后，根据感染肠炎沙门氏菌的盲肠内容物细菌含量结果，选择实 验组中细菌含量最多的3-6只寿光鸡；任意选择对照组中等数量的寿光鸡；被选中的每个 寿光鸡的脾脏作为一个样本。
[0024] 根据感染肠炎沙门氏菌的盲肠内容物细菌含量结果，选择接种后14日龄脾脏样 品做全基因组甲基化测序（MEDIP-seq)，对照组3-6个样本，实验组3-6个样本。
[0025] S3、从各个样本中提取DNA，实验组和对照组各构建1个DNA混池，利用DNA的破碎 试剂盒（Bioo Scientific Corporation)将各个DNA混池中的DNA打断至150_800bp的大 小不等片段，用T4DNA聚合酶和克列诺酶将得到的所有片段修饰成平末端。
[0026] S4、用Agencourt公司的产品AMPure XP磁珠筛选300_400bp大小的修饰成平末 端的DNA片段并纯化。
[0027] S5、在筛选出的DNA片段的平末端的序列末端加腺嘌呤变成粘性末端。
[0028] 在平末端的序列末端加腺嘌呤变成粘性末端，可以减少在连接接头序列时各DNA 片段之间的互连，保证接头序列与DNA片段片段之间的特异性连接。
[0029] S6、将筛选出的DNA片段与接头序列连接，采用甲基化DNA沉淀试剂盒（Zymo Research Corp.，Cat.#D5101)对连接完成后的序列样品进行甲基化的DNA富集，验证扩增 纯化后进行测序以确定甲基化发生差异的具体基因。
[0030] S7、进行数据分析，获得MeDIP-Seq总数据产出统计表，根据DMR位置和长度计算 各染色体上DMR占每条染色体的百分比，总结DMR在各个区域的分布情况；进行甲基化差异 基因的鉴定，获得基因 CGI的DMRs分类饼图以及基因角度的DMRs分类饼图，对甲基化差异 基因进行基因本体论分析，差异基因的信号通路分析，显著差异基因甲基化的倍数变化。
[0031] MEDIP是甲基化DNA免疫共沉淀的简称，MEDIP-seq是通过抗5-甲基胞嘧啶（5mC) 的抗体分离出甲基化的DNA片段，通过高通量测序在全基因组水平上进行高甲基化区域的 研宄，被用于富集甲基化的DNA的序列，甲基化在生物学过程中发挥着重要的作用。DMR是 甲基化差异区域，是指不同样本中的不同的甲基化状态的基因组区域。
[0032] 其中，MeDIP-Seq数据产出统计表如表1所示：
[0033] 表I MeDIP-Seq总数据产出统计
[0034]
【主权项】
1. 一种鸡肠炎沙门氏菌感染甲基化调控基因的鉴定方法，其特征在于，包括以下步 骤： 51、 选择沙门氏菌阴性寿光鸡，均分为试验组和对照组；所述试验组通过口腔灌服法接 种0. 3ml肠炎沙门氏菌，2-4 X IO8Cfu/只，所述对照组接种0. 3mL的磷酸盐缓冲溶液； 52、 接种14天后，根据感染肠炎沙门氏菌鸡只盲肠内容物细菌含量结果，选择实验组 中细菌含量最多的个体3-6个；任意选择对照组中等数量的个体；被选中的每个个体的脾 脏作为一个样本； 53、 从各个样本中提取DNA，实验组和对照组各构建1个DNA混池，利用The AIRtmDNA破 碎试剂盒将各DNA混池中的DNA打断至150-800bp的大小不等DNA片段，用T4DNA聚合酶 和克列诺酶将得到的所有DNA片段修饰成平末端； 54、 用Agencourt公司的产品AMPure XP磁珠筛选300_400bp的修饰成平末端的DNA 片段并纯化； 55、 在筛选出的DNA片段的平末端序列末端加腺嘌呤变成粘性末端； 56、 将筛选出的DNA片段与接头序列连接，采用甲基化DNA沉淀试剂盒对连接完成后的 序列样品进行甲基化DNA富集，验证扩增纯化后进行测序以确定甲基化发生差异的具体基 因； 57、 进行数据分析，获得MeDIP-Seq数据产出统计表，各染色体上DMR所占百分比，DMR 在各个区域的分布情况，甲基化差异显著基因的基因本体论功能分析，差异基因的信号通 路分析，显著差异基因甲基化的倍数变化； 58、 通过对甲基化差异基因的鉴定和对基因的功能和信号通路分析，结合差异基因的 甲基化倍数变化，鉴定得出肠炎沙门氏菌感染中发挥甲基化调控的基因。
【专利摘要】本发明提供了一种鸡肠炎沙门氏菌感染甲基化调控基因的鉴定方法，涉及生物基因工程技术领域，可以鉴定在鸡肠炎沙门氏菌感染中发挥甲基化调控作用的基因。所述方法包括利用鸡脾脏组织样品为试验材料，对其进行处理后，进行甲基化DNA富集，验证扩增纯化后进行测序；通过对基因甲基化差异的鉴定和对基因功能和信号通路的分析，结合基因甲基化差异倍数变化，鉴定得出肠炎沙门氏菌感染中发挥甲基化调控的基因。
【IPC分类】C12R1-42, C12Q1-68
【公开号】CN104561330
【申请号】CN201510027797
【发明人】李显耀, 王莎莎, 刘丽英, 吴桂贤
【申请人】山东农业大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月17日