水稻茎节腐烂病的pcr检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种水稻病的检测方法，尤指一种检测水稻茎节腐烂病（rice stem-node rot)的PCR (聚合酶链式反应）方法。
【背景技术】
[0002] 水稻茎节腐烂病是我们最近在湖南省水稻上发现的一种新病害，此病一旦发生， 减产高达50%以上。2009年7月在湖南桃源县茶庵铺镇中稻上发现一种特殊的枯心症状， 枯心苗茎节及其上部约1厘米范围内发黑腐烂，病田水稻病丛率达到了 50%以上，采用细 菌分离，但未分离到细菌性基腐病菌。2010年，湖南邵阳县又出现同样症状的水稻病株，此 次同样未能分离到细菌性基腐病菌。2011年8月，凤凰县、湘乡县和平江县发生了茎腐症 状。此后在花垣、浏阳、武闪、宜章、通道、茶陵和江华等县均报告此病发生，发病田一般发病 率达到50% -80%，严重的可达到80 %以上。感染该病的水稻病株呈现枯心、死孕穗或死 杆，叶鞘上有不规则形褐条痕迹症状，剥开叶鞘可见自茎节处及茎节以上约1厘米范围内 均变黑、腐烂，腐烂处易断。症状明显不同于细菌性基腐病，命名为水稻茎节腐烂病（rice stem-node rot)〇
[0003] 从凤凰县、湘乡县和平江县的水稻茎节腐烂病病株共分离得到数个病原菌株，形 态相似。菌落外观初期呈白色圆形毛绒状，培养皿反面可观察到淡橘色，由中心向边缘逐渐 淡去呈白色。在光学显微镜下菌丝为有隔菌丝，具分枝，菌丝体上形成分生孢子梗生，轮生， 顶部着生单个分生孢，或形成瓶体状分生孢子梗，顶部分生孢子成团；分生孢子无色，无隔， 长椭圆形，大小为4. 1 μπιΧ8. 2 μ??。经rDNA ITS4和ITS5引物对其中的HNFH0UHNXX01和 HNPJOl菌株（分别来自凤凰县、湘乡县和平江县）进行PCR扩增，经测序后得到的rDNA-ITS 序列，BLAST结果表明三个菌株都与截孢帚枝霉S.attenuatum(CBS414.81)的碱基序列 100%相同。据此鉴定该HNFHOl、HNXXOl和HNPJOl为截孢帚枝霉（S. attenuatum)。
[0004] 研宄表明此水稻茎节腐烂病菌可经种子传带，因此种子带菌检测就显得格外重 要。对于水稻种子是否携带有病原真菌，以前主要通过对种子所携带的微生物进行分离培 养，再根据培养物所产生孢子的形态特征进行鉴定。这种方法不仅分离培养时间长，同时也 由于杂菌污染影响分离效果，检出效率不高。因此，有必要建立一种能准确鉴定水稻茎节腐 烂病的快速分子检测方法。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种能准确鉴定 水稻茎节腐烂病的PCR检测方法。该方法所使用的一对引物是水稻茎节腐烂病菌的转录间 隔区（internal transcribed spacer 1，ITS)特异的，本检测方法所使用的这对引物有别 于其它检测方法。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种水稻茎节腐烂病的 PCR检测方法，该方法是以水稻茎节腐烂病菌特异性引物对待测样品进行PCR扩增，最后电 泳鉴定；该特异性引物为：
[0007] 正向引物：5-TCGTTCCCTCGGCGGGAT-3(SEQ ID No. 1);
[0008] 反向引物：5-AGGTGCGCCCCGAAGGGT-3(SEQ ID No. 2);
[0009] 上述特异性引物的设计是基于水稻茎节腐烂病菌的转录间隔区的核苷酸序列， PCR产物大小为295bp。
[0010] 对本发明方法详细叙述如下：
[0011] -、引物设计：
[0012] 本发明人利用真核生物进化过程中核酸序列的保守性，从NCBI搜索并下载水稻 莖节腐烂病菌（claSarodium attenuatum)菌系 CBS 414. 81 和 C277 和稻帚枝霉 S. oryzae 菌系CBE-5的转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS)的核苷酸序列（序列登录 号分别为AY 566997、AB705154和JN689380)以及本申请人从表现茎节腐烂病症状的水稻 病株分离得到的3个菌株HNFH01、HNXXOl和HNPJOl (【背景技术】中已述）的ITS序列（序 列登录号分别为KJ777679、KJ777680和KJ777681)，运用MEGA4. 0软件对这些序列进行比 对，从扩展名为mas的文件中找出不同研宄者报告的以上核苷酸序列所共有而其它真菌序 列均与之不同的引物候选区，设计出一对引物（由宝生物工程（大连）有限公司合成）：
[0013] 正向引物：5-TCGTTCCCTCGGCGGGAT-3(SEQ ID No. 1);
[0014] 反向引物：5-AGGTGCGCCCCGAAGGGT-3(SEQ ID No. 2);
[0015] 将正向引物和反向引物分别经BLAST检索，结合参见图1及图2,结果表明，与正 向引物和反向引物的序列100%覆盖且100%相同的全部是水稻茎节腐烂病菌的核苷酸序 列。
[0016] 二、DNA 的提取：
[0017] 采取下述方法分别提取水稻茎节腐烂病株以及带水稻茎节腐烂病菌的种子DNA :
[0018] (1)将SDS分离缓冲液置于60°C水浴中预热。
[0019] (2)称取0.5g菌丝，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快将菌丝研碎。（或加预热 的SDS分离缓冲液，用石英砂研磨）
[0020] (3)将粉末装入无菌I. 5mL的离心管中，加入600uL预热的SDS分离缓冲液中，轻 轻转动使之混匀。
[0021] (4)样品于 65°C保温 10min。
[0022] (5)加等体积的7. 5mol/L的NaCL，轻轻颠倒混勾。
[0023] (6)冰浴 8min，IOOOOrpm 离心 5min。
[0024] (7)取600uL上清液至EP管中，加等体积（600uL)的氯仿-异戊醇（24:1)，轻轻 颠倒混匀，IOOOOrpm离心10分钟。
[0025] (8)将上层水相吸入另一干净的离心管中，加入0. 1倍体积的NaAc和2体积的预 冷无水乙醇（或1倍体积的预冷异丙醇），轻轻混匀，-20°C冰箱放置lh，使核酸沉淀下来。
[0026] (9)收集 DNA : IOOOOrpm 离心 10min，去上清。
[0027] (10)70%酒精洗绦，洗涤2次。
[0028] (11)酒精挥发后，用0· 1倍TE或CldH2O溶解，-20 °C分装保存备用。
[0029] 三、PCR 过程：
[0030] 采用上述引物对分别对水稻茎节腐烂病株以及带水稻茎节腐烂病菌的种子的DNA 进行PCR检测。预期PCR产物为295bp。
[0031] PCR反应体系为25 μ 1，具体见下表1 :
[0032] 表I PCR反应体系各主要成分及用量
[0033]
【主权项】
1. 一种水稻茎节腐烂病的PCR检测方法，其特征在于：该方法是以水稻茎节腐烂病菌 特异性引物对待测样品进行PCR扩增，最后电泳鉴定；该特异性引物为： 正向引物：5-TCGTTCCCTCGGCGGGAT-3 ; 反向引物：5-AGGTGCGCCCCGAAGGGT-3。
2. 如权利要求1所述的水稻茎节腐烂病的PCR检测方法，其特征在于：所述特异性引 物的设计是基于水稻茎节腐烂病菌的转录间隔区的核苷酸序列，PCR产物大小为295bp。
【专利摘要】一种水稻茎节腐烂病的PCR检测方法，是以水稻茎节腐烂病菌特异性引物对待测样品进行PCR扩增，最后电泳鉴定；该特异性引物是基于水稻茎节腐烂病菌的转录间隔区的核苷酸序列，是水稻茎节腐烂病菌的转录间隔区特异的，本检测方法所使用的这对引物有别于其它检测方法，可以用于快速检测出水稻茎节腐烂病。
【IPC分类】C12Q1-04, C12Q1-68
【公开号】CN104561337
【申请号】CN201510031605
【发明人】高必达, 王姝玮
【申请人】湖南农业大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月22日