血管紧张素转化酶抑制二肽的制作方法
【专利说明】血管紧张素转化酶抑制二肽 【技术领域】
[0001] 本发明涉及具有抑制血管紧张素转化酶（ACE)的活性，由此示血压降低作用的有 用的15种二肽及含有其的肽组合物。得到本发明的二肽、及肽组合物的制法是将热水提取 鱼肉性蛋白质、特别是鲣节时作为残渣残留的不溶性蛋白质由蛋白NY100 (天野酶）酶水解 而得到的二肽吸附到疏水性树脂之后，由含水醇脱离、再使透过超滤膜（分子量1000)，该 强的ACE抑制活性级分可作为血管紧张素转化酶抑制剂及血压降低剂的有效成分利用。期 待本发明的ACE抑制活性高的二肽及含有所述二肽的肽组合物对于高血压症的治疗或预 防有用。 【【背景技术】】
[0002] 高血压症是代表性的生活习惯病，在日本该患者数是包括预备军在内，有5490万 人（厚生劳动省：2006年国民健康一营养调查结果）。另外，根据2012年的WHO的调查， 报告世界人口的4分之一是高血压症或其预备军。高血压症自觉症状少，也被称为沉默杀 手，已知引起脑出血、蛛网膜下出血、脑梗塞、心肌梗塞、心绞痛、肾硬化症等各种的并发症， 对于高血压症的发症机制进行着各种各样的研宄。
[0003] 作为血压的调节系统，与升压相关的肾素一血管紧张素系统和与降压相关的激肽 释放酶一激肽系统发挥重要的作用。在肾素一血管紧张素系统中，从肝脏分泌的血管紧张 素原由在肾脏生产的肾素变成血管紧张素 I，再者由血管紧张素转化酶（ACE)变换为血管 紧张素 II。此血管紧张素 II使血管平滑肌收缩，使血压升高。另一方面，降压系统的激肽 释放酶作用于激肽原而产生缓激肽。此缓激肽有扩张血管，降低血压的效果，ACE有分解此 缓激肽的作用。如此，已知ACE由作为升压肽的血管紧张素 II的产生和作为降压肽的缓激 肽的灭活的两个作用而与血压的升高相关。
[0004] 从而，通过抑制此ACE的酶活性抑制血压的升高成为可能。作为此ACE抑制活性 物质开发的作为脯氨酸衍生物的卡托普利（D-2-甲基-3-巯基丙酰-L-脯氨酸）或依那普 利等被广泛用于高血压症的治疗。但是，制药的情况中，由服用确认作为副作用的干咳，在 QOL方面有问题也是事实。另外，已知停药就反弹。
[0005] 从而，有要从天然物调查有降压作用的成分，或者从天然物纯化，活用的动向。其 中，最近报告，食品原料蛋白质的酶分解物的肽有ACE抑制活性。例如，对于明胶的胶原酶 分解物（专利文献1)、酪蛋白的胰蛋白酶分解物（专利文献2、专利文献3及专利文献4)、 沙丁鱼肌肉的胃蛋白酶分解物（专利文献5)、鲣节的嗜热菌蛋白酶分解物（专利文献6)、 芝麻蛋白的嗜热菌蛋白酶分解物（专利文献7)、K-酪蛋白的胃蛋白酶等的分解物（专利 文献8)等有多数的报告。这些肽由于天然物来源的血管紧张素转化酶抑制剂从食品或食 品原料得到，所以期待成为低毒性、且安全性高的降压剂。
[0006] 微生物或各种食品中也发现ACE抑制物质，作为降压剂的实用化被探讨（非专利 文献1)。
[0007] 然后，对于有ACE抑制活性的肽的制造法也有几个报告（专利文献9、10、11、12、 13、14、15)。
[0008] 【现有技术文献】
[0009] 【专利文献】
[0010] 专利文献1 :特开昭52-148631号公报
[0011] 专利文献2 :特开昭58-109425号公报
[0012] 专利文献3 :特开昭61-36226号公报
[0013] 专利文献4 :特开昭61-36227号公报
[0014] 专利文献5 :特开平3-11097号公报
[0015] 专利文献6 :特开平4-144696号公报
[0016] 专利文献7 :特开平8-231588号公报
[0017] 专利文献8 :特开平8-269088号公报
[0018] 专利文献9 :特开平6-7188号公报
[0019] 专利文献10 :专利第2794094号公报
[0020] 专利文献11 :专利第2873318号公报
[0021] 专利文献12 :特开2006-347937号公报
[0022] 专利文献13 :特开2001-240600号公报
[0023] 专利文献14 :特开平6-298794号公报
[0024] 专利文献15 :特开2010-155788号公报
[0025] 【非专利文献】
[0026] 非专利文献1 :末网邦男、发酵和工业、46卷（No. 3)、179?182页（1988) 【
【发明内容】
】
[0027] 【发明要解决的技术课题】
[0028] 食品原料来源的有ACE抑制活性的肽在副作用、毒性等的安全性的方面问题少， 能作为通常的食品摄取成为大的益处。
[0029] 但是，上述的报告的肽的多种是其构成氨基酸数是5个以上的（专利文献1、2、3、 4、5、8)。这些氨基酸残基数多的肽被摄取后，容易地被胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶 等的消化酶分解，它们的ACE抑制活性在活体中消失，或另外，在不分解时也因其分子结构 大而难以吸收。
[0030] 再者，对于ACE抑制肽组合物或其制法，在专利文献9中，从超滤膜（分子量 3000?10000)透过液得到由低分子成分的逆渗透膜除去的级分的有血压降低作用的ACE 抑制肽混合物，但以由盐、游离氨基酸的除去的抑制活性的升高作为目的，不至分级分离， 明确不进行在逆渗透膜的具体性的成分肽的追迹。在专利文献10中，可从无花果来源的分 子量10000以下的物质由柱层析分离纯化、得到作为目的的寡肽，但可合成制造，其单离方 法终始，具体而言不至可从天然物产业上有效的工业生产，仅示超滤膜10000的纯化。专利 文献11有是玉米醇溶蛋白或麸粉的嗜热菌蛋白酶水解物，由分子量是10000以下的级分的 含有量以固体成分基准是30%以上的凝胶过滤或超滤得到的方法，但未示分子量10000透 过液中含的分子量1000以下的含有量是95%的根据。专利文献12中得到含有畜肉蛋白 质来源的血压降低肽，将肌球蛋白、肌动蛋白用AMNOS等的酶水解的肽的组合物，但对于 纯化而言，仅止于实验室规模，记载有单离肽的合成。其工业上大量生产只不过谈及了一般 酶制备方法。另外，在抑制肽的纯化中使用树脂，但以结构确定作为其目的。专利文献13 记载了将蛋白质的ACE抑制酶分解物使用平均细孔直径3nm以下的活性炭处理的方法，可 不使ACE抑制活性降低而除去苦味或气味。不以抑制活性的升高作为目的。专利文献14 提案使接触合成树脂而向非吸附级分除去苦味肽的方法，记载在非吸附级分上残留抑制活 性。另一方面，在本发明中，在吸附级分确认高ACE抑制活性，在非吸附级分示ACE不抑制 活性，再者可在超滤的透过液中得到消化抗性更优良的低分子的ACE抑制活性肽。
[0031] 再者得到的ACE抑制活性肽可通过装载到HPLC，以一次的HPLC操作，纯化、单离、 鉴定高抑制活性二肽。一般而言，在从酶分解物的肽的单离中，需要多次、5次左右的柱操 作，因而被指烦琐，这证实，本发明的ACE抑制肽以很好的精度分级分离，提示不要的肽的 存在少。再者，本发明的ACE抑制肽是ACE抑制活性高的肽的集合体，所以，示高的降压效 果的效价。
[0032] 从而，本发明的课题是提供，经口摄取时难以由消化酶分解，难失在体内的ACE抑 制活性的，能直接小肠粘膜吸收的、有高ACE抑制活性的二肽和含有其的肽组合物。
[0033] 再者，本发明提供含有一种以上上述的二肽的血管紧张素转化酶抑制剂或血压降 低剂或饮食用组合物（饮食料或特定保健用食品）。
[0034] 如上述一样，天然有机物及食品来源的血管紧张素转化酶抑制物质，由于具有对 人体的安全性，因此重要性高，对于生活习惯病预防也是大的研宄课题。
[0035] 本发明为了解决此课题而进行，在食品原料中发现通过有效地抑制血管紧张素转 化酶来抑制血压升高的新颖且安全的物质，明确该抑制物质的结构的同时，开发在品质及 价格方面适度的浓缩法，旨在提供含血管紧张素转化酶抑制物质的食品原料。
[0036] 【解决课题的技术方案】
[0037] 考虑将热水提取鲣节之后作为残渣残留的水不溶性蛋白质用作为蛋白酶的蛋白 NY100 (天野酶）水解而得到的生成分解物中是否存在解决上述问题的肽，探索是否该生成 分解物之中含有氨基酸数是2个以下、且有ACE抑制活性的肽。
[0038] 结果，在作为鲣节热水提取残渣的水不溶性蛋白质的由蛋白NY100(天野酶）的水 解生成物中发现具有下述的氨基酸序列、并且有ACE抑制活性的5种二肽，成功单离这些二 肽，从而完成本发明。
[0039] S卩，本发明提供是含有鲣、鲣荒节、鲣枯节、宗田鲣、宗田鲣节、沙丁鱼、沙丁鱼节、 竹荚鱼、竹荚鱼节、鲭、鲭节、煮干、或者，其他杂节的鱼肉性蛋白质来源的、具有血管紧张素 转化酶抑制活性的二肽的组合物，且以含有选自由色氨酸-亮氨酸的氨基酸序列组成的二 肽、由亮氨酸-色氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由色氨酸-异亮氨酸的氨基酸序列组成的 二肽、由缬氨酸-酪氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由色氨酸-天冬酰胺的氨基酸序列组 成的二肽、由缬氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、由色氨酸-酪氨酸的序列组成的二肽、由 色氨酸-甲硫氨酸的序列组成的二肽、由甲硫氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、由异亮氨 酸-色氨酸的序列组成的二