一种鸡源性抗鸡新城疫病毒p蛋白的胞内抗体、制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的胞 内抗体、制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 新城疫病毒（NDV)属副粘病毒，其引起的新城疫（ND)是一种对世界养禽业危害极 为严重的传染病。NDV的基因组编码6种结构蛋白：核衣壳蛋白（NP)，磷蛋白（P)，基质蛋 白（M)，融合蛋白（F)，血凝素-神经氨酶（HN)和RNA依赖的RNA聚合酶蛋白（L)。另外，P 基因还可通过RNA的编辑作用编码2种蛋白质：V蛋白和W蛋白，P，V，W蛋白具有相同的N 端和不同的C端。研宄表明，副粘病毒进入细胞后，首先转录产生mRNA，翻译出早期蛋白 (NP，P蛋白），二者与L蛋白共同组成病毒的核糖核蛋白复合体（RNP)之后，病毒mRNA才能 翻译出其他晚期蛋白（F蛋白、HN以及M蛋白等），进而组装成病毒粒子出芽。此外，P蛋白 还能与未组装的前体NP结合，形成P-NP复合物，该复合物既可激活病毒基因组复制，也可 阻止前体NP与病毒RNA非法组装形成核衣壳。由此可见，新城疫病毒进入宿主细胞后能否 顺利复制增殖，其中能否形成RNP是最为关键的。因此，深入研宄转录复合体（RNP)关键的 P蛋白，无论是对于病毒复制增殖机制研宄，还是新型抗病毒药物研发都是非常必要的。
[0003] 胞内抗体技术是一种全新的可阻断细胞内靶蛋白功能的技术，它通过特异性干扰 或阻断分布于该部位的某些生物大分子的活性或加工、分泌过程，引起细胞的一系列生物 过程发生改变。根据胞内抗体的构建策略，将单链抗体克隆到真核表达载体，转染宿主细 胞，使表达的胞内抗体定位于亚细胞区室。
【发明内容】
[0004] 鉴于NDV转录复合体蛋白（RNPs)在病毒复制增殖过程中所处的关键环节，本发明 构建了能够与新城疫病毒RNPs关键的P蛋白结合的胞内抗体，利用胞内抗体对RNPs进行 抑制，可获得最大程度的抗病毒效果，为新城疫的预防和控制提供一种新的方法。
[0005] 本发明技术方案具体阐述如下。
[0006] 本发明提供一种鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的胞内抗体的制备方法，其通过将 鸡源性抗NDV的P蛋白的单链抗体编码基因克隆到真核表达载体pcDNA3. 1，构建获得鸡源 性抗鸡新城疫病毒P蛋白的胞内抗体。具体步骤如下：
[0007] (1)将鸡源性抗NDV的P蛋白的单链抗体scFv ZL1编码基因装入克隆载体 PMD18-T中，构建克隆质粒pMD18-T-scFvZLl ;
[0008] (2)将真核表达载体pcDNA3. 1和克隆质粒pMD18-T-scFvZLl用Hindlll和EcoRI 限制酶进行双酶切，纯化回收；
[0009] (3)采用T4DNA连接酶将scFvZLl基因和pcDNA3.1(+)的双酶切回收片段连接，得 到重组质粒pcDNA3.1-scFvZLl，即鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的胞内抗体。
[0010] 本发明还提供上述制备方法得到的鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的胞内抗体。
[0011] 进一步的，本发明提供上述制备方法得到的鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的胞内 抗体用于制备预防和/或治疗新城疫药物。
[0012] 本发明将鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的胞内抗体pcDNA3. 1-scFvZLl转染BHK21 细胞，通过提取细胞内RNA，分析胞内抗体的mRNA水平和抗体蛋白表达水平；并通过G418 试剂获得尽可能多的含有胞内抗体的细胞。抗NDV的P蛋白的胞内抗体能与NDV的P蛋白 在感染的宿主细胞内特异性结合，阻断了 RNPs的形成，表现了显著的细胞内抗病毒活性， 能够用于鸡新城疫的治疗。
【附图说明】
[0013] 图1为胞内抗体重组质粒pcDNA3. 1-scFvZLl。
[0014] 图2为构建的胞内抗体真核表达质粒中scFvZLl基因及其表达产物序列。
[0015] 图3为Western-blot分析单链抗体在转染细胞中的表达图。（1，阳性对照；2, 3. 胞内抗体；4.阴性对照。）
[0016] 图4为H血凝实验（HA)实验检测胞内抗体对细胞的保护效果图。
【具体实施方式】
[0017] 实施例1抗鸡新城疫病毒P蛋白的重组质粒（pcDNA3. 1-scFvZLl)的构建
[0018] 1、真核表达载体（pcDNA3.1)及克隆质粒（PMD18-T-scFvZLl)基因的酶切
[0019] 本发明早先将筛选到的鸡源性抗NDV的P蛋白的单链抗体（scFv ZL1)(申 请号：2013102369637)编码基因装入克隆载体（pMD18-T)中，构建成克隆表达质粒 (pMD18-T- SCFvZLl)。为了构建抗NDV的P蛋白的胞内抗体真核表达质粒，首先将真核表达 载体pcDNA3. 1和PMD18-T-scFvZLl基因片段用同样的限制酶进行消化。Hindlll，1 y 1 ; EcoRI，1 y 1 ;pMD18-T-scFvZL115 y 1，pcDNA3. 115 y 1，ddH20 补充至 50 y 1，37°C酶切 2. 5h 后常规方法回收。
[0020] 2、目的基因片段（pcDNA3. 1与scFvZLl)进行连接
[0021] 采用T4连接酶将scFvZLl基因和pcDNA3. 1 (+)的双酶切回收片段连接。操作步 骤如下：l〇XLigation buffer 1 y 1，pcDNApcDNA3. 1 载体双酶切回收片段 1 y 1，scFvl03 基因双酶切回收片3 y 1，T4DNA连接酶1 y 1，补ddH20至10 y 1上述连接产物混匀后16°C 连接过夜，构建成重组质粒pcDNA3. 1-scFvZLl (胞内抗体）（见图1)，其基因序列和氨基酸 序列分别如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示。测序证明所构建胞内抗体真核表达质粒序 列正确（见图2)
[0022] 实施例2重组质粒pcDNA3. 1-scFvZLl转染BHK21细胞
[0023] 1、药物筛选浓度的确定
[0024] 为了获得更多的转化细胞，需要对转染的BHK21细胞进行G418药物处理.将 BHK21细胞培养于含不同浓度的G418的DMEM培养基（含10%血清）中，G418浓度设定为 200、300、400、500、600、700、800、900、1000 y g/ml，细胞培养 7-14 天，已杀死全部细胞的最 低药物浓度确定为BHK21细胞稳定转染的筛选浓度。
[0025] 结果显示，G418的浓度降至200 y g/ml的维持浓度，约10-14天后出现细胞克隆。 因此，本发明确定200 y g/ml为G418的最佳维持浓度。
[0026] 2、转染流程
[0027] (1)转染前一天，将BHK21细胞接种到24孔板中，每个孔中加入1. 5-2X 105个细 胞，控制细胞转染时的密度为60-80% ;
[0028] (2)转染前lh取出细胞板，去除原有细胞培养基，加入40