一种双特异性抗体cd19×cd3的构建及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫学的技术领域。具体地说涉及双特异性抗体的构建和制备方法， 以及双抗体功能和性质检测方法。
【背景技术】
[0002] 双特异性抗体（bispecificantibody，BiAb)是含有两种特异性抗原结合位点的 人工抗体，能在靶细胞和功能分子（细胞）之间架起桥梁，产生导向性的效应功能。BiAb在 生物医学中，特别是在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。通过BiAb介导细胞毒作用 杀死肿瘤细胞是当前免疫治疗应用研宄的热点，其主要特点是BiAb能同时结合肿瘤相关 抗原和免疫效应细胞上的靶分子，直接触发免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。以下 是针对所研宄的免疫细胞抗原和肿瘤细胞抗原，以及相关技术发展的一些【背景技术】介绍。
[0003] 1.CD3
[0004] CD3分子由4个亚基组成：S、e、丫、6，其分子质量分别为18. 9kDa、23.IkDa、 20. 5kDa、18. 7kDa，其长度分别有171、207、182、164个氨基酸残基。它们一起组成6条 肽链，常与T细胞受体（Tcellrec印tor，TCR)紧密结合形成含有8条肽链的TCR-CD3 复合体，结构示意图见图1。此复合体具有T细胞活化信号转导，稳定TCR结构的功能。 ⑶3胞质段含免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptortyrosine-basedactivation motif,ITAM)，TCR识别并结合由MHC(majorhisto-compatibilitycomplex)分子提呈的抗 原肽，导致CD3的ITAM的保守序列的酪氨酸残基被T细胞内的酪氨酸蛋白激酶p561ck磷 酸化，然后可募集其他含有SH2(Scrhomology2)结构域的酪氨酸蛋白激酶（如ZAP-70)。 ITAM的磷酸化和与ZAP-70的结合是T细胞活化信号传导过程早期阶段的重要生化反应之 一。因此，CD3分子的功能是转导TCR识别抗原所产生的活化信号。
[0005] 2.CD19
[0006] ⑶19在正常及恶性B淋巴细胞中均有表达，被视为B细胞发育过程中一个涵盖阶 段较长的最为可靠的表面标记物。在正常淋巴组织中，⑶19表达于生发中心的B细胞和滤 泡树突状细胞、套细胞、滤泡间T细胞区的树突状大细胞，与CD20和CD22染色模式基本相 同，但同⑶20相比，⑶19在前B细胞中也表达。此外，通过流式细胞学检测方法，⑶19在 人体组织分离得到的浆细胞中可以检测到。通常来说⑶19在B淋巴细胞瘤中表达，其中包 括B淋巴细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、边 缘区淋巴。
[0007] 3.双特异性抗体技术发展
[0008] 双特异性抗体，一个抗体分子中的两个抗原结合部位可分别结合两种不同的抗原 表位的抗体。
[0009] 抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的生物 大分子药物，具有特异性高、性质均一、可针对特定靶点定向制备等优点。单克隆抗体在临 床上主要应用于以下三个方面：肿瘤治疗、免疫性疾病治疗以及抗感染治疗。其中肿瘤的治 疗是目前单抗应用最为广泛的领域，目前已经进入临床试验和上市的单抗产品中，用于肿 瘤治疗的产品数量占比大概为50%。单克隆抗体治疗肿瘤是一种针对病变细胞特异靶点刺 激免疫系统来杀伤靶细胞的免疫疗法，为了增强抗体的效应功能，特别是杀伤肿瘤细胞的 效果，人们尝试多种方法改造抗体分子，双特异性抗体是改善抗体治疗效果的发展方向之 一，现已成为抗体工程研宄领域的热点。
[0010]用于免疫治疗的双特异性抗体是含有2种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在 靶细胞和功能分子（细胞）之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，在肿瘤的免疫治疗 中具有广阔的应用前景。
[0011] 4.双特异性抗体制备
[0012]双特异性抗体可通过多种途径获得，其制备方法主要有：化学偶联法、杂交一杂交 瘤法和基因工程抗体制备法。化学偶联法是将2个不同的单克隆抗体用化学偶联的方式连 接在一起，制备出了双特异性单克隆抗体，这是最早的双特异性单克隆抗体概念。杂交一杂 交瘤法是通过细胞杂交法或者三元杂交瘤的方式产生双特异性单克隆抗体，这些细胞杂交 瘤或者三元杂交瘤是通过建成的杂交瘤融合，或者建立的杂交瘤和从小鼠得到的淋巴细胞 融合而得到的，只能生产出鼠源的双特异性抗体，它的应用受到了极大的限制。而随着分子 生物学技术的迅速发展，出现了基因工程人源化双特异性抗体的多种构建模式，并主要分 为双特异性微抗体，双链抗体，单链双价抗体，多价双特异性抗体四类。目前，国际上已有数 种基因工程双特异性抗体药物进入临床试验阶段，并显示有较好的应用前景。
[0013] 5.肿瘤的过继免疫治疗
[0014]肿瘤的过继免疫治疗是将自体或异体的免疫活性细胞经过体外扩增后输入患者 体内，直接杀伤肿瘤细胞，调节和增强机体的免疫功能，主要包括LAK细胞、TIL细胞、激活 的T淋巴细胞和CIK细胞的免疫治疗。而免疫疗法只能清除少量的、零散的肿瘤细胞，对于 晚期的实体肿瘤疗效有限。故常将其作为一种辅助疗法与手术、化疗、放疗等常规方法联合 应用。先用常规方法清扫大量的肿瘤细胞后，再用免疫疗法清除残存的肿瘤细胞，可提高肿 瘤综合治疗的效果。其中，过继免疫治疗作为肿瘤综合治疗中的一个新方法，已经与常规手 术治疗、放疗、化疗及其他细胞和分子治疗得到广泛配合，在多种肿瘤的治疗中展示了广泛 的应用前景。然而，一种更理想的方式应该是，双特异性抗体一端可以结合培养好的免疫细 胞的表面抗原CD3,并随之一起输入体内，而双特异性抗体的另一端能很好地结合肿瘤细 胞的表面抗原；这样，双特异性抗体就能在体内架起肿瘤细胞和免疫细胞之间的桥梁，使免 疫细胞集中在肿瘤细胞周围，进而对肿瘤细胞进行杀伤。通过这种方法可有效解决肿瘤细 胞的转移和扩散，克服了手术、放化疗三大传统治疗方式后的"不彻底、易转移、副作用大" 等弊端。
【发明内容】
[0015] 术语和缩略语
[0016] BiAb:双特异性抗体（bispecific antibody)
[0017] TA:肿瘤抗原（tumor antigen)
[0018] VH:重链可变区（heavy chain variable region)。
[0019] VL:轻链可变区（light chain variable region)〇
[0020] CL:轻链恒定区（constantregionoflightchain)。
[0021] CDR :是英文Complementarity determining regions (CDRs)的缩写，是指抗体的 抗原互补决定区。
[0022] ScFv :单链可变区抗体片段（single-chain variable fragment)，又称为单链抗 体。
[0023]CLD:细胞系开发（celllinedevelopment)
[0024] FACS:焚光激活细胞分选（Fluorescence-activated cell sorting)，也称为流式 细胞分选术。
[0025] 本发明针对常规单克隆抗体的不足之处，通过基因工程和抗体工程的方法进行的 新分子-双特异性抗体的创制，在传统单克隆抗体主要通过CDC，ADCC和凋亡能力来杀伤肿 瘤细胞的基础上，增加了介导T细胞的免疫疗法，大大提高了免疫系统杀伤肿瘤细胞的功 效。
[0026] 具体地，本发明提供了以下的技术方案：
[0027] 在一种实施方式中，提供一种双特异性抗体，其特征在于，所述该抗体包含：(a) 单价单元，为轻链-重链对，该轻链-重链对针对肿瘤细胞表面抗原具有特异性结合能力， 优选地该肿瘤细胞表面抗原是CD19、CD20、CD30和CD133,更优选地该肿瘤细胞表面抗原是 CD19;和（b)单链单元，为融合肽，该融合肽包含单链可变片段ScFv和具有铰链区、CH2结 构域和CH3结构域的Fc片段，其中该融合肽针对的免疫细胞选自T细胞、NKT细胞或CIK细 胞；优选地，该融合肽对免疫细胞表面抗原CD3具有特异性结合能力。
[0028] 在一种实施方式中，所述双特异性抗体的单链单元的CH2结构域位于ScFv片段和 CH3结构域之间。
[0029] 在一种实施方式中，双特异性抗体的单链可变片段由轻链可变区和重链可变区结 构域组成，它们都靶向于抗原表位CD3。
[0030] 在一种实施方式中，在单价单元中，轻链通过二硫键与重链结合；重链通过一个或 多个二硫键与所述融合肽结合。
[0031] 在一种实施方式中，单价单元包括针对人源⑶19的抗体抗-⑶19;
[0032] 在一种实施方式中，抗体抗-CD19的重链的氨基酸序列为序列号1所示的氨基 酸序列，抗体抗-CD19的轻链的氨基酸序列为序列号3所示的氨基酸序列，以及所述的 抗-⑶3ScFv-Fc的氨基酸序列为序列号5所示的氨基酸序列；并且抗-⑶19重链在227位 点上的半胱氨酸与抗-CD19的轻链218位点上的半胱氨酸以二硫键的形式连接，所述的 抗-⑶19重链在233和236位点上的半胱氨酸与抗-⑶3ScFv-Fc的255和258位点上的半胱 氨酸分别以二硫键的形式连接，所述的抗-⑶19重链在399和416位点上与抗-⑶3ScFv-Fc 的428和397位点上形