8a-MICA扩增获 得，上游引物P3 :5 '-TAGGTGGTGGTGGTGGITCAGAACCTCACAGCCTG-3' 和下游引物：5 '-GCTCTAG AGCTCAATGATGATGATGATGATGCTTGCCGCTTGGGAC3'。下端划线的碱基对是EcoRl和Xbal的限制 性酶切位点。单链抗体的C末端与MICA使用一个链接物（linker)G4S(G-甘氨酸，s-丝氨 酸）通过overlapPCR进行融合，使用的是上游引物P1和下游引物P4。扩增好的目的基因 (AK404R-MICA)和载体pPICZa用限制性内切酶EcoRl和Xbal进行连接并转入到DH5a。 阳性克隆在含有25yg/ml博来霉素的LB平板中挑取出来并测序。
[0036] 获得的重组载体口？扣2(1^1(4041?，扣4使用电穿孔方法进行电转入毕赤酵母 (X-33)，阳性克隆在含有100yg/ml博来霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖培养平板（YPD)筛选 出来，示意图与结果如图1所示。
[0037] 实施例2融合抗体的表达和纯化
[0038] 从50个阳性克隆使用SDS-PAGE和westernblot挑选出高表达的克隆进行发酵。 高表达克隆在lOmlYPD液体培养基（含有100yg/ml博来霉素）30°C、220rpm过夜培养至 0D_:2-4,以1 : 1000接种到200ml的BMGY(2%蛋白胨，1%酵母提取物，lOOmM磷酸钾缓 冲液（PH6. 0)，1. 34 %YNB，4X10_5生物素，1 %甘油）30°C、220rpm过夜培养至OD6QQ: 1-2， 3000g离心5min去除上清后用200ml的BMMY(2%蛋白胨，1%酵母提取物，lOOmM磷酸钾缓 冲液（PH6. 0)，1. 34%YNB，4X10_5生物素）并加入0. 5 %的甲醇30°C、220rpm培养，每隔24 小时加入0. 5%的甲醇发酵4天。第六天，收集上清得到分泌的融合抗体用镍柱进行纯化。 纯化后如图2A所示。
[0039] 实施例3融合抗体的的WesternBlot鉴定
[0040] 纯化得到的KDR3和NKG2D与AK404R(作为control)进行变性SDS-PAGE电泳，分 离胶浓度为15%;4°C，20mA恒流转印1. 5h，将蛋白转印到PVDF膜（购自Millipore);转印 结束，将膜在5%MTBS(含有5%脱脂牛奶的TBS)中37°C封闭2h;用5%MTBS稀释融合抗 体，4°C过夜孵育，TBST(TBS中含有 0? 05%Tween-20)洗涤 3 遍，每次 10min;用anti-MICA 的抗体37°C进行2h孵育后，用5%MTBS按1 : 5000稀释HRP-anti-Mouse二抗（购自 Millipore)，37°C孵育1.5h，TBS洗涤3遍，每次10min;用ECL溶液曝光，结果如图2E，2F 所示。
[0041] 实施例4表面等离子体共振分析配体和受体间相互作用
[0042] 采用BiacoreXlOO(GE)来对KDR3、NKG2D和融合抗体的动力学进行研宄，融合抗 体螯合在检测芯片GM5(GEHealthcare，BR-1000-12)，KDR3(250,125,62. 5,31. 5,15. 6， 7. 8nM)和NKG2D(250,125,62. 5,31. 5,15. 6,7. 8nM)上样检测获得结合与解离曲线，BIA评 估软件分析，计算获得动力学常数。实验结果如图3A，3B所示。
[0043] 实施例5酶联免疫吸附试验（ELISA)
[0044] 每孔加入100y1NKG2D或KDR3(10000nm，溶解在CBS)4°C过夜包被。清洗后每 孔加入200yl5%的脱脂牛奶37°C封闭2h。每孔加入250ylTPBS(PBScontaining 0.05%Tween20)微量震荡仪清洗5min，重复3次，用不同浓度的融合抗体（0.5,1，2， 3. 9, 7. 8,15. 6, 31. 3,62. 5,125,，250, 500,，1000nM)室温包被 1. 5h，TPBS和PBS各洗三次， 再加入anti-MICAmonoclonalantibody室温孵育 1. 5h，用 5%MTBS按 1 : 5000 稀释 HRP-anti-Mouse二抗（购自Millipore)室温孵育1. 5h，TBS洗绦3遍，每次10min。每孔 加入 100y1 显色液（0? 03%H202和 2mg/mlTMB溶解于 0? 1MNaAcbuffer，pH6. 0,现配现 用），37°C孵育15min。每孔加入50y1终止液（1MH2S04)，酶标仪检测0D45Q-0D65Qnm吸光 值。结果如图3C，3D所示。
[0045] 实施例6流式细胞术检测融合抗体与HUVEC，U937和HEK293的结合率
[0046] 调节HUVEC，U937和HEK293细胞浓度至2X106个/mL，每个1. 5mLEP管中各加 250yL单细胞悬液。阴性对照组：先用5%脱脂牛奶封闭，2%FBS-PBS洗涤3遍后，只加入 500yLFITC标记的荧光二抗冰浴孵育lh;样品组：先用5%脱脂牛奶封闭，2%FBS-PBS洗 涤3遍后，2000nM的融合抗体冰浴孵育lh，2%FBS-PBS洗涤3遍后，再加入500yLFITC 标记的荧光二抗冰浴孵育lh;最后将各组样品用2%FBS-PBS洗涤3遍后，用500yLPBS 溶液重悬细胞，BDFACS流式细胞仪检测。实验结果如图4A，4B，4C，4D**。
[0047] 实施例7细胞增殖实验
[0048] 4xl03个HUVEC，U937和HEK293细胞接种到96孔板上在37°C，5%CO2的培养箱中 培养 24h，不同浓度梯度（OnM，3. 9nM，7. 8nM，15. 6nM，31. 2nM，62. 5nM，125nM，250nM，500nM， lOOOnM)的融合抗体加入培养24,48和72小时，AK404R，MICA和PBS作为对照组。每孔加 入11y1MTT，37°C培养箱孵育4h。弃去含有MTT的培养基，加入DMS0,酶标仪（Thermo)在 570nm和630nm检测吸光度，分析实验结果，计算IC5(I值。实验结果如图5A，5B所示。
[0049] 实施例8Transwell侵袭实验
[0050] 1X104个HUVEC细胞和不同浓度梯度的融合蛋白（20nM，100nM和500nM)用无 血清ECM培养基重悬细胞并铺于按1 : 2稀释的Matrigel基质（购于Millipore)胶上。 AK404R(20nM，100nM和 500nM)，MICA(500nM)和PBS(500nM)作为对照。于 37°C、5%C02 培 养箱中孵育30min后，在下室中每孔加入600yL含5%FBS和20ng/mLECGS的ECM完全培 养基，最后，将transwell小室转移至含培养液的下室中，然后置于37°C、5%C02培养箱中 培养作用12h。培养后用4°C预冷的4%多聚甲醛600yL/孔固定20分钟后染色拍照。实 验结果如图6A，6B所示。
[0051] 实施例9细胞毒实验
[0052]CytoTox96NonradioactiveCytotoxicityassay(购于Promega)，革巴细胞分别 为K562,MDA-MB-435,B16F10和3T3-L1 (对照组）。白细胞从健康人中分离得到作为效应 细胞。效应细胞和靶细胞以5 : 1，30 : 1和100 : 1共同培养并加入融合蛋白，AK404R和 MICA在37°C培养5h。吸取50yL上清按照试剂盒指示进行LDH活性检测。杀伤活性（％ ) =[(0D实验组-0D总自然释放）A0D最大释放组-0D总自然释放）]X100 %。实验结果如 图7所示。
【主权项】
1. 一种VEGFR2的单链抗体与MICA融合蛋白，具有以下特征：包括以KDR胞外3区为 抗原的单链抗体AK404R和MICA，通过基因重组等手段，利用一个Linker (G4S)连接。
2. -种分离的核酸，含有权利要求1所示该核酸编码上述的抗体。
3. -种表达载体，含有权利要求1的核酸。
4. 一种重组宿主细胞，含上述的表达载体。
5. -种毕赤酵母分泌表达法，其特征在于：用于分泌表达权利要求1所述的融合抗体 AK404R-MICA。
6. 上述任一项的融合抗体或融合抗体片段的应用，选择性地与KDR3结合或NKG2D结合 的融合抗体。
7. 权利要求1抗体的偶联物。
8. 权利要求1所述的VEGFR2的单链抗体与MICA融合蛋白在治疗肿瘤药物中的应用。
【专利摘要】本发明属基因工程抗体技术领域，具体地公开了一种抗人血管内皮细胞生长因子受体2的单链抗体(AK404R)与MICA连接的融合抗体的制备方法及用途。本发明公开了融合抗体表达质粒的构建，重组质粒的转染。本发明还提供表达和纯化融合抗体的方法，通过真核细胞分泌表达、亲和层析纯化获得融合抗体。本发明的融合抗体AK404R-MICA可特异性结合于人血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)，可以显著抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、迁移、细胞侵袭和小管形成。本发明的融合抗体AK404R-MICA还可以显著抑制肿瘤细胞K562的生长，可应用于制备诊断剂和治疗剂。
【IPC分类】C12N1-19, C12N15-62, A61K39-395, C07K19-00, C12N15-81, A61K38-17, A61P35-02, C12R1-84
【公开号】CN104592395
【申请号】CN201510038297
【发明人】王旻, 戴斯蒙德·奥马内·阿奇姆彭, 唐铭英, 张娟, 王佑富, 赵欣, 袁锡彬
【申请人】中国药科大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月27日