基于荧光共振能量转移技术的Caspase-8活性检测荧光探针的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于酶活性的高效检测技术领域，具体涉及一种基于蛋白酶类荧光共振能量转移技术(FRET )而设计的活细胞酶活性检测探针。
【背景技术】
[0002]Caspase家族为天冬氨酸蛋白酶家族，主要功能是参与细胞凋亡通路，是细胞凋亡的执行者。在死亡受体介导的外源性凋亡通路中，Caspase-8发挥着重要作用。Caspase-8酶原一个显著的特点是在其N端有2个70 aa左右的结构域，与Fas相关死亡结构域蛋白(Fas-associated death domain protein , FADD)的 N 端的死亡效应结构域(deatheffector domain, DED)同源,这种同源的死亡效应结构域之间可以发生相互聚合,提供了 Caspase-8与FADD相互结合的一个部位。Caspase-8酶原激活后能够激活细胞中其他Caspase家族成员，如Caspase-3和Caspse-7的活化过程都有Caspase-8的参与。活化的Caspase-3又能进一步激活下游其他Caspase,从而导致细胞凋亡。在凋亡过程中，Caspase-8通过其N端的DED结构域与FADD相互结合，间接与细胞膜受体发生联系，从而将细胞膜事件转化为细胞浆事件。因此，Caspase-8在外源性的死亡受体介导的凋亡通路的信号传导中以及细胞凋亡执行中都具有重要的作用，因此对于Caspase-8酶活性的检测具有重要的意义，目前对于Caspase-8活性的检测通常为western Bloting或者突光底物检测，这类检测方法都需要对目的细胞进行裂解，而不能在活细胞水平进行酶活性检测。
[0003]突光共振能量转移技术(fluorescenceresonance energy transfer,FRET)是一种通过检测两个荧光分子之间的非放射性的能量转移的技术，FRET的产生依赖于这两个荧光基团之间的物理距离。当发生FRET的两个荧光蛋白之间距离小于或等于1nm时，发生高FRET效率，当它们距离大于10 nm时，则不发生FRET。此技术的发现使得生命科学研究中发展出一系列的相关技术。例如，FRET能够用来检测分子内或分子间的相互作用；基于蛋白酶类的FRET能够用来测定蛋白酶的活性:即在两个能够发生FRET的两个荧光蛋白之间引入特定的蛋白酶识别酶切位点，通过蛋白酶的切割使得FRET从强到弱、甚至有到无的变化，从而检测蛋白酶的活性。对于FRET效率的检测传统检测平台是基于荧光显微镜平台以及活细胞工作站平台，该检测方法在对单细胞中FRET荧光效率变化具有很好的测定效果，但对于测定细胞群体FRET水平的变化则有一定的局限性。因此，基于流式细胞仪平台的荧光共振能量转移(flow cytometric FRET，FCET)应运而生，FCET能够在整体细胞水平测定细FRET效率的变化，从而能够对FRET变化进行定量分析，这为FRET技术的运用开辟了更广阔的前景。
【发明内容】
[0004]本发明的第一目的是提供一种新的基于荧光共振能量转移技术的Caspase-8活性检测荧光探针EBFP2-C8_EGFP，便于在流式细胞仪平台检测细胞中Caspase-8活性。
[0005]本发明的第二目的是提供含有上述Caspase-8活性检测荧光探针EBFP2_C8_EGFP的真核表达载体及其构建方法。
[0006]本发明的第三目的是提供上述Caspase-8活性检测荧光探针的用途。
[0007]本发明的第四目的是提供上述Caspase-8活性检测荧光探针检测细胞中Caspase-8活性的方法。
[0008]本发明通过以下技术方案来实现:
一、一种新的基于荧光共振能量转移技术的Caspase-8活性检测荧光探针，为EBFP2-C8-EGFP，其中，EBFPjP EGFP分别表示增强型蓝色荧光蛋白以及增强型绿色荧光蛋白，C8表示Caspase-8的蛋白酶识别切割位点。
[0009]进一步的，其中Caspase-8的蛋白酶识别切割位点C8的特征序列是IETDGGIETD。
[0010]进一步的，所述的Caspase-8活性检测荧光探针，其核苷酸序列如SEQ ID No:l所示，基因全长1494 bp，编码498个氨基酸。
[0011]二、含有权利要求1所述的Caspase-8活性检测荧光探针的真核表达载体。
[0012]上述的含有Caspase-8活性检测荧光探针的真核表达载体的构建方法，该方法包括以下步骤:
(1)EBFP2基因片段的获得；
(2)将EBFP2基因片段连入真核表达载体；
(3)C8-EGFP片段的获得；
(4)C8-EGFP片段连入包含有EBFP2基因片段的真核表达载体。
[0013]三、上述的Caspase-8活性检测荧光探针在细胞中Caspase-8活性检测中的应用。
[0014]进一步的，所述的细胞为MCF-7细胞。
[0015]四、一种应用上述的Caspase-8活性检测突光探针检测细胞中Caspase-8活性的方法，包括将含有Caspase-8活性检测荧光探针的真核表达载体转染细胞，然后用流式细胞仪检测。
[0016]进一步的，在所述的流式细胞仪检测中，采用的激发通道为355nm氪离子激发通道以及488nm氩离子激发通道。
[0017]具体的，在355nm氪离子激发通道中，利用带通450/50和530/30分别检测EBFP2荧光信号和EBFPgIj EGFP的FRET信号，在488nm氩离子激发通道中用带通530/30检测EGFP荧光信号。
[0018]采用上述技术方案的积极效果:本发明在能够有效发生FRET效应的两个荧光蛋白EBFP2和EGFP之间引入了 Caspase-8的酶切识别位点IETDGGIETD，在细胞内转染表达该融合荧光探针EBFP2-C8-EGFP，通过测定表达该探针细胞中FRET效率的变化来确定C8酶切位点被切割的效率从而确定细胞中Caspase-8活性的高低，并且通过在流式细胞仪平台上实现了该检测技术，使得这一检测方法能够更加快速、简便、高通量的实现。本研究为Caspase-8抑制剂类药物提供了一个快速、高通量的筛选平台。
【附图说明】
[0019]图1是本发明中探针设计的工作原理图；
图2是本发明中探针融合蛋白结构示意图； 图3中，a是实施例3中双标法细胞凋亡检测结果，b是细胞凋亡检测统计结果；
图4中，a是实施例4中流式细胞仪FRET测定结果，b是FRET效率测定统计结果。
【具体实施方式】
[0020]本发明中生物材料的来源:
1、pUC57-EBFP2(EBFP2由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并保存于该公司的pUC57载体中)
2、pEGFP-Cl载体(购于 B1Vector NTCC Inc.)
3、所有引物为自行设计并委托(南京金斯瑞生物科技有限公司)合成。
[0021]下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，按常规条件，如《分子克隆实验指南》第3版(J.莎姆布鲁克、D.W.拉塞尔等主编，黄培堂等译.北京，科学出版社，2005)中所述方法进行。流式细胞仪测定结果均用FlowJo7.6.1流式分析软件进行后续分析，结果用GraphPad Prism 5统计软件进行作图分析,所有结果采用平均数土标准误(Means土S.E.M)，采用双尾t检验，P〈0.05认为有统计学显著性差异。本文采用相对FRET效率评价FRET效率:利用阴性对照确定FRET阳性细胞群后，FRET效率表示在发生FRET的两个荧光蛋白的双阳性细胞群中FRET阳性细胞所占的比例。
[0022]实施例1.FRET荧光探针真核表达质粒EBFP2-C8-EGFP的构建
以 pUC57-EBFP2 为模板，以 5’ -CTAGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGC-3’ 和5，-CCCAAGCTTGAGCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTC-3 ’ 为上下游引物，，经常规的PCR反应获得两端含Nde I和Hind III酶切位点的EBFP2基因片段。利用Nde I /Hind III双酶切PCR获得的EBFP2基因片段和pEGFP-Cl载体，用T4 DNA连接酶连接分别回收的双酶切后的载体DNA和EBFP2基因片段。连接产物转化到大肠杆菌ToplO感受态菌株，涂布卡那霉素抗性LB平板，经菌落PCR筛选出阳性克隆后进行DNA序列分析鉴定。DNA序列分析完全正确的克隆即为将pEGFP-Cl载体中EGFP基因置换为EBFPj^ pEBFP 2_C1真核表达质粒，该克隆构建中除了将EGFP置换成EBFPJh，表达载体的其他任何部分都没有发生改变。