用于通过连续灌注和交互切向流来培养细胞的方法
【专利说明】用于通过连续灌注和交互切向流来培养细胞的方法
[0001] 本发明是申请日为2005年3月4日、申请号为200580007175. 4、题为"用于通过 连续灌注和交互切向流来培养细胞的方法"的申请的分案申请。
[0002] 本发明涉及对细胞的灌注培养（perfusionculturing)。
[0003] 本发明公开了一种方法，用于通过对细胞培养物进行连续灌注培养来培养细胞， 所述细胞培养物包含细胞培养基和细胞，其中，细胞培养基被加入到细胞培养物中，其中， 细胞培养物在包含中空纤维的过滤器模块上循环，导致液体流出物的细胞密度较细胞培养 物要低，而过滤器模块内的流是交互切向流。
[0004] 我们惊奇地发现，按照本发明对动物（特别是哺乳动物）细胞或酵母细胞进行灌 注培养，可以获得极其高的存活细胞密度，而细胞培养物进一步展示出极其高的细胞存活 率（viability)。此外，还发现，本发明的灌注方法使得培养物内细胞聚集更少，甚至能获得 单个的细胞的悬浮液，而没有可见的聚集物。这是令人惊奇的发现，因为使用低剪切条件， 例如，在灌注细胞培养中，典型地，不会使细胞不聚集。灌注细胞培养期间的细胞聚集是不 利的，因为例如细胞聚集物中细胞代谢情况不均一使得过程控制会更难。如果细胞形成了 5个或更多个细胞的聚集物，以及当聚集物总的来说包含细胞总量中5%或更多的时候，这 就尤其麻烦。
[0005] 在US6, 544, 424中描述了一种灌注方法。虽然，该文献提到，该方法可以被用于 对动物细胞进行灌注培养，但是其既没有公开也没有暗示本发明中发现的高细胞密度。此 夕卜，US6, 544, 424B1中公开，该灌注过程可以减少中空纤维膜表面上障碍物的粘附和生 长，但是其既没有公开也没有暗示细胞培养物中的细胞本身会更少地聚集。
[0006] Voisieretal. (Biotechnol.Bioeng. 82(2003)，751-765)对悬浮哺乳细胞高密 度灌注培养中的多种细胞驻留技术进行了综述。其中提到的细胞驻留系统中没有一种能够 提供本发明的极其高的存活细胞密度以及极其高的细胞存活率。
[0007] 细胞灌注培养在本领域中有其传统含义，即，这意味着，在培养期间，通过分离设 备来保留细胞，其中存在较之分离前具有更低的细胞密度的液体流出物，并且存在细胞培 养基流入物。在本发明的方法中，该分离设备是包含中空纤维的过滤器模块。
[0008] 灌注培养包括但不限于，连续流和半连续流，例如，逐步流（st印-Wiseflow)或交 错流（staggeredflow) 〇
[0009] 术语"中空纤维"指管状的膜。该管的内径优选在0. 3至6. 0mm之间，更优选地， 在0? 5至3. 0mm之间，最优选地，在0? 5至2. 0mm之间。优选地，膜的网孔大小被选择为：网 孔中孔的大小接近细胞直径，确保细胞能驻留下来，而细胞残骸能通过过滤器。优选地，网 孔大小为3-30ym。
[0010] 包含中空纤维的过滤器模块可通过商业途径获得，例如，从GeneralElectric(以 前的Amersham)获得。
[0011] "过滤器模块内的交互切向流"指：在与中空纤维的膜表面相同的方向上（即，与 之相切的方向）存在一道流，所述的流来回流动，在与所述过滤器表面基本垂直的方向上 存在另一道流。可以根据本领域技术人员已知的方法来获得切向流。例如，在US6, 544, 424 中描述过，可以用一个泵使细胞培养物在包含中空纤维的过滤器模块上循环，用另一个泵 移出细胞密度较过滤器分离之前更低的液体，由此获得交互切向流。
[0012] 在本发明的方法中，适用于培养细胞的任何类型的细胞培养基原则上都可使 用。选择细胞培养基及细胞培养条件的方针都是本领域内公知的，并且在例如Freshney， R.I.Cultureofanimalcells(amanualofbasictechniques)，4thedition2000， wiley-Liss的第 8 章和第 9 章以及Doyle，A.，Griffiths，J.B.，Newell，D.G.Cell&Tissue culturelaboratoryProcedures1993,Johnwiley&Sons中提供过。
[0013] 通常，用于哺乳动物细胞的细胞培养基包含盐、氨基酸、维生素、脂类、去垢剂、 缓冲液、生长因子、激素、细胞因子、微量元素和碳水化合物。盐的例子包括镁盐，例如 MgCl2 ? 6H20、MgS0#MgS04 ? 7H20 ;铁盐，例如FeS04 ? 7H20 ;钾盐，例如KH2P04、KC1 ;钠盐，例 如NaH2P04、Na2HP04和钙盐，例如CaCl2 ? 2H20。氨基酸的例子是全部20种已知的蛋白质源 氨基酸，例如，组氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸。维生素的例子包括：抗坏血酸、 生物素、胆碱C1、肌醇、D-泛酸、核黄素。脂类的例子包括：脂肪酸，例如亚油酸和油酸；大豆 蛋白胨和乙醇胺。去垢剂的例子包括Tween80和PluronicF68。缓冲液的例子是HEPES。 生长因子/激素/细胞因子包括IGF、氢化可的松和（重组）胰岛素。微量元素的例子是本 领域技术人员已知的，其包括Zn、Mg和Se。碳水化合物的例子包括葡萄糖、果糖、半乳糖和 丙酮酸盐/酯。
[0014] 细胞培养基的pH、温度、溶解氧浓度和渗透压摩尔浓度（osmolarity)原则上并不 重要，其取决于所选用细胞的种类。优选地，PH、温度、溶解氧浓度和渗透压摩尔浓度被选择 为：其对于细胞的生长和生产率来说是最优的。本领域技术人员知道如何找到对灌注培养 来说最优的pH、温度、溶解氧浓度和渗透压摩尔浓度。通常，最优pH介于6. 6和7. 6之间， 最优温度介于30至39°C之间，最优渗透压摩尔浓度介于260至400m0sm/kg之间。
[0015] 可有利地用本发明方法处理的细胞可以是从本发明的方法获得好处（即培养至 极其高的存活细胞密度以及极其高的细胞存活率）的任何种类的细胞。
[0016] 根据本发明的方法，极其高的存活细胞密度是每mL至少80xl06个细胞的密度，优 选地，每mL至少lOOxlO6个细胞，更优选地，每mL至少110x10 6个细胞，更优选地，每mL至 少120xl06个细胞，更优选地，每mL至少130x10 6个细胞，最优选地，每mL至少140x10 6个 细胞。典型地，细胞密度的合适上限可以是每mL大约500xl06个细胞。
[0017] 令人惊奇地，本发明的极其高的细胞密度还伴随着极其高的细胞存活率。极其高 的细胞存活率是至少为90 %的存活率，优选为至少95 %，更优选为至少97 %，最优选为至 少 99%。
[0018] 应当理解，非常高的存活细胞密度和非常高的细胞存活率是在灌注培养进行一段 时间之后达到的，通常是当细胞达到稳定状态后，对哺乳动物细胞而言，典型的是灌注培养 初始化之后12至25天。
[0019] 本发明的方法适合用于培养动物细胞或酵母细胞，尤其适合用于培养哺乳动物细 胞。
[0020] 本发明的方法还尤其适合用于对培养期间（尤其是灌注培养期间）容易形成或固 有地会形成聚集物的细胞（所谓的聚集细胞）进行培养。令人惊奇地，本发明的方法不仅 能减少过滤器膜上的聚集物分布，还能减少灌注培养期间细胞的聚集，甚至是减少固有地 趋向于形成聚集物的细胞的聚集。根据本发明对聚集细胞的培养能使得培养物中至少5个 细胞的聚集物仅包含细胞总数的至多5%，优选地，至多4%，更优选地，至多3%，进一步更 优选地，细胞总数的至多2%。尤其优选地，根据本发明对聚集细胞的培养使得培养物是真 正的单个的细胞的悬浮液。
[0021] 聚集细胞是形成至少5个细胞的聚集物的细胞，所述聚集物占到细胞总数的至少 5%。优选地，聚集物由至少6个，更优选至少7个，进一步更优选至少8个，进一步更优选 至少9个，进一步更优选至少10个细胞组成。优选地，聚集物总的来说包含细胞总数的至 少7 %，更优选至少10 %，最优选15 %。
[0022] 哺乳动物细胞的例子包括：CHO(中国仓鼠卵巢）细胞、杂交瘤、BHK(幼仓鼠肾）细 胞、骨髓瘤细胞、人类细胞（例如ffiK-293细胞、人成淋巴细胞、PER.C6?细胞）、小鼠细胞