一种嘧菌酯降解菌及其生产的菌剂和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及应用环境微生物和农业领域，具体涉及一种嘧菌酯降解菌及其生产的 菌剂和应用，具体用于修复嘧菌酯污染的水体或土壤等自然环境，保护生态环境和人类健 康。
【背景技术】
[0002] 嘧菌酯，又名阿米西达，是一种最常用的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂。嘧菌酯在1996 年开始上市并投入到农业生产应用中，目前已在全球72个国家、80多种作物病害上获得登 记使用。该杀菌剂拥有全所未有的超广杀菌谱，对子囊菌、担子菌、半知菌和卵菌纲中的绝 大部分病原真菌均有较好的抑菌活性，近年来已被广泛用于防治作物病害，是市场上的主 要杀菌剂品种。
[0003] 随着嘧菌酯使用的日益广泛和使用时间的延长，加之耐光、热的特点，其在土壤中 的降解半衰期长达56?279天，因此有关该农药的残留问题及其危害日益严重。大量研究 表明，嘧菌酯对非靶标生物的危害性日益凸显，如对一些有益昆虫如蜜蜂等造成了极大危 害，对鱼类和水生无脊椎动物具有很高的毒性。此外，该杀菌剂具有环境激素效应，长期接 触或摄入将导致慢性疾病，对人类、鸟类和其他哺乳动物具有慢性毒性。因此，消除环境中 嘧菌酯的残留污染已成为科研工作者亟待解决的具有重大经济和社会意义的科研命题。
[0004] 生物修复（Bioremediation)技术因其操作简便、经济实用、环境友好等优点，已 成为处理各类环境污染物的有效措施。国际上已有利用生物修复技术成功治理石油污染的 先例。近年来，研究利用生物修复技术治理农药残留污染已成为研究热点。目前许多发达 国家和大公司都投入巨资以从事农药残留生物降解制剂的研究和开发，如美国BCI公司、 美国工程服务生物修复公司已经将降解制剂产品规模化生产，国内的北京佳农新贸易发展 有限公司已成功生产"比亚"生物降解制剂可用于去除有机磷类农药残留。但是，由于农药 结构多样性，而微生物降解农药往往具有很强的针对性，导致现有降解菌资源库远不能满 足农药残留污染生物修复的实际需求。目前还没有专门针对嘧菌酯的降解微生物及其相关 降解制剂产品。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供一株降解嘧菌酯的苍白杆菌{Ochrobactrumanthropi)SH14〇
[0006]本发明的另一目的是提供所述菌株在降解嘧菌酯农药残留中的应用。
[0007]本发明的另一目的是提供所述菌株在制备降解嘧菌酯的制剂中的应用。
[0008]本发明的另一目的是提供一种降解嘧菌酯的制剂。
[0009]本发明的另一目的是提供所述降解嘧菌酯的制剂在降解嘧菌酯农药残留中的应 用。
[0010] 本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的： 一株降解啼菌酯的苍白杆菌（Ochrobactrumanthropi)SH14,所述菌种保存在中国典 型培养物保藏中心（CCTCC)，地址为中国武汉，武汉大学，保藏号为CCTCCN0:M2013681， 保藏日期为2013年12月20日。
[0011] 所述菌株经形态学特征、生理生化特性、16SrDNA系统发育分析及API20NE系 统鉴定为苍白杆菌，该菌株在LB固体平板中生长很快，呈现白 色或淡黄色，菌落小而平、稍透明、边缘整齐、表面较湿润。通过生理生化特性测定，显示该 菌株属于革兰氏阴性杆菌，好氧，接触酶、氧化酶阳性。该菌可利用葡萄糖、阿拉伯糖、甘露 糖、癸酸、柠檬酸、麦芽糖、萍果酸、硝酸钾和展乙酰-D-葡萄糖胺；不利用精氨酸、明胶、七 叶灵、己二酸、甘露醇、脲素、色氨酸、葡萄糖酸盐、苯乙酸和对硝基-3-D-甲基半乳糖。 [0012] 一种降解嘧菌酯的制剂，所述制剂由以下方法制备得到： 51. 将所述苍白杆菌SH14的菌株于种子培养基中培养，获得菌种； 52. 将上述菌种按种子罐培养基的体积比的5%?10%的接种量接种入含有种子培养基 的种子罐，培养至对数生长期，获得种子液； 53. 将获得的种子液按照5%?10%的接种量接种入含有发酵培养基的生产发酵罐发酵 培养,出罐形成液体菌剂； 在种子罐和生产发酵罐的培养过程中，无菌空气的通气量为0. 45?0. 60m3/min，搅 拌速度为200?250r/min，温度30 °C，全流程培养时间约为48h，发酵结束后菌体数量 > 1.0X109CFU/mL，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成制剂； 其中，所述的种子培养基、种子罐所用的培养基、生产发酵罐所用的培养基相同，配方 均为：酵母膏〇. 5%，蛋白胨1%，NaCl1%，pH值为7. 5。
[0013] 所述的苍白杆菌SH14制剂稀释之后喷施到农作物、土壤或水体中，稀释后的液体 菌剂中菌体数量至少达到1.0X107CFU/mL。
[0014] 所述的苍白杆菌SH14在降解嘧菌酯中的应用。
[0015] 所述的苍白杆菌SH14制剂在降解水体、土壤中嘧菌酯的应用。
[0016] 本发明的有益效果如下： 本发明筛选获得一株苍白杆菌SH14,该菌株可在短时间内 有效降解嘧菌酯农药残留，可用于修复嘧菌酯污染的水体、土壤等自然环境，解决农业生产 中农药残留超标问题及环境污染问题，保护生态环境和人类健康。
[0017] 本发明进一步提供了使用苍白杆菌SH14生产制备得到的液体菌剂，具有生产成 本低，使用方便，去除效果好等优点，适合治理水体和土壤等环境中嘧菌酯造成的污染，具 有非常重要的理论和应用价值。
【附图说明】
[0018] 图1.苍白杆菌SH14降解嘧菌酯产生透明圈。
[0019] 图2.苍白杆菌SH14的16SrDNA系统进化分析。
[0020] 图3.苍白杆菌SH14降解50mg/L嘧菌酯的HPLC色谱图。
[0021] 图4?嘧菌酯标准品的HPLC色谱图（50mg/L)。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合说明书附图和具体实施例来进一步详细阐述本发明。以下实施例为本 发明较佳的实施方式，但并不对本发明的保护范围做任何形式的限定。本发明主要阐述所 述菌株以及基于所述菌株的应用思想，实施方式中简单参数的替换不能一一在实施例中赘 述，但并不因此限制本发明，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修 饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，都应包含在本发明范围内。
[0023] 除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设 备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
[0024] 实施例1苍白杆菌SH14的分离和鉴定 本发明人通过富集培养法分离、筛选嘧菌酯降解菌。用来富集嘧菌酯的环境样品采 集自新加坡污水处理池中的活性污泥。取活性污泥样品5g加入50mL基础培养基(配方 ： (NH4)2S04, 2g;MgS04, 0. 2g;CaCl2, 0.01g;FeS04, 0 . 00 5g;MnCl2, 0.002g; K2HP04, 10. 5g;KH2P04, 4. 5g，蒸馏水1000mL，pH7. 5)中。同时加入嘧菌酯原药母液 (DMS0为溶剂），使嘧菌酯最终质量浓度为50mg/L，于30 °C、150r/min摇床下进行降解 微生物富集培养。培养7d后，按10%的接种量转接到第二批含100mg/L嘧菌酯的基础培 养基中。相同条件培养7d后，再按10%的接种量转接到含嘧菌酯为200mg/L的基础培养 基中，继续培养7d。以此类推，不断增加嘧菌酯的质量浓度。最后取0.2mL基础培养基发 酵液均匀涂抹到含嘧菌酯的固体平板中反复进行划线分离，直至得到单菌落，并使用高效 液相色谱法（HPLC)验证其降解效果。
[0025] HPLC测定条件如下： HPLC型号：2690 型（Waters,USA);色谱柱：C18 反相柱（Phenomenex, 250nmX4.60mm, 5iim);流速：1mL/min;柱温：常温（28 ± 1 °C);流动相：乙腈：水= 70:30 (含 0. 1%乙酸）；检测波长：220nm;进样量：10yL。在上述条件下，嘧菌酯峰形由一个峰组成， 且峰尖锐、稳定，保留时间为5. 677min(见图4)。
[0026] 降解率计算方法如下：
【主权项】
1. 一株降解啼菌酯的苍白杆菌（a/7tAro/7i) SH14,其特征在于，所述菌 株已于2013年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏号是CCTCC NO :M 2013681。
2. 根据权利要求1所述菌株，其特征在于，所述菌株在LB固体平板上呈现白色或淡黄 色，菌落小而平、稍透明、边缘整齐、表面较湿润。
3. 权利要求1或2所述菌株在降解嘧菌酯农药残留中的应用。
4. 权利要求1或2所述菌株在制备降解嘧菌酯的制剂中的应用。
5. -种降解嘧菌酯的制剂，其特征在于，所述制剂由以下方法制备得到：
51. 将所述苍白杆菌SH14的菌株于种子培养基中培养，获得菌种；
52. 将上述菌种按种子罐培养基的体积比的5%?10%的接种量接种入含有种子培养基 的种子罐，培养至对数生长期，获得种子液；
53. 将获得的种子液按照5?10%的接种量接种入含有发酵培养基的生产发酵罐发酵 培养,出罐形成液体菌剂； 在种子罐和生产发酵罐的培养过程中，无菌空气的通气量为0. 45?0. 60 m3/min，搅 拌速度为200?250 r/min，温度30 ° C，全流程培养时间约为48 h，发酵结束后菌体数量 彡 1. 0X109 CFU/mL ; 其中，所述的种子培养基、种子罐所用的培养基、生产发酵罐所用的培养基相同，配方 均为：酵母膏〇. 5%，蛋白胨1%，NaCl 1%，pH值为7. 5。
6. 权利要求5所述的制剂在降解嘧菌酯农药残留中的应用。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，权利要求5所述的制剂在降解水体或土壤 中嘧菌酯农药的应用。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将权利要求5所述的制剂稀释后喷洒到水 体或土壤中，稀释后的制剂中菌体的数量至少达到1.0X10 7 CFU/mL。
【专利摘要】本发明公开了一种嘧菌酯降解菌及其生产的菌剂和应用。所述菌株为苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi) SH14，所述菌株已于2013年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号是CCTCC NO：M 2013681。该菌株可在短时间内有效降解嘧菌酯农药残留，可用于修复嘧菌酯污染的水体、土壤等自然环境。以该菌株制备得到的制剂，具有生产成本低，使用方便，去除效果好等优点。使用本菌剂可在短时间内使水体和土壤中嘧菌酯的残留量降低85%以上，有效修复嘧菌酯污染的自然环境，解决农业生产中农药残留超标问题及环境污染问题，保护生态环境和人类健康。CCTCC NO：M201368120131220
【IPC分类】C02F101-38, C12N1-20, B09C1-10, C12R1-01, C02F3-34
【公开号】CN104593287
【申请号】CN201410774486
【发明人】陈少华, 刘诗胤, 廖立胜, 程莹莹, 王惠杉
【申请人】华南农业大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2014年12月16日