稳定表达抗agr2人源化单克隆抗体的cho细胞株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体 的CH0细胞株及其应用。
【背景技术】
[0002] AGR2(Humananteriorgradient-2,HAG-2)，又名人前梯度蛋白，是一种蛋白质 的二硫键异构酶。AGR2是首先在1998年由KuangW.等在表达雌激素受体的人乳腺癌 细胞株中，通过比较筛选发现的一种生物学标记蛋白（KuangWW,ThompsonDA，Hoch RV，etc.Nucleicacidsresearch, 1998,26(4): 1116-1123)。同年由ThompsonA?和 WeigelJ.通过分子生物学方法得到全长的cDNA克隆，比较后发现其与非洲爪蟾的前梯 度蛋白（Xenopusanteriorgradient,XAG-2)同源，功能与蟾蜍的发育有关，并命名为 AGR2(ThompsonDA,WeigelRJ.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunicatio ns，1998, 251 (1) : 111-116.)。虽然人类的AGR2蛋白是XAG-2的同源物，但是与XAG-2不同的 是，人的AGR2蛋白主要分布在由内胚层分化出的气管、肺部、胃部、结肠等部位，因此AGR2 在人的正常组织发育中起着某些作用。虽然AGR2在正常组织中有表达，并具有生理功能， 但是在肿瘤细胞中AGR2是一个相对于正常细胞更高度表达的分泌蛋白，AGR2能扰乱正常 细胞的生长，促进肿瘤的形成、生长与转移。
[0003] 因此，AGR2在肿瘤组织与正常组织中表达量存在差异，在正常细胞的生长、发育中 起着重要的调节作用，也与肿瘤等疾病的发生、发展有密切关系。因此，AGR2是一个潜在的 肿瘤治疗靶标。
[0004] 单克隆抗体在肿瘤治疗中具有特异性强，副作用小的特点。由于AGR2能促进肿瘤 的形成、生长与转移，抗AGR2单克隆抗体能够与AGR2特异性地结合，从而达到抑制肿瘤形 成、生长与转移的治疗性效果。在公开号CN101519649的专利中，公布了一种能够分泌鼠源 抗AGR2单克隆抗体的杂交瘤细胞株18A4及其制备方法。但是鼠源单克隆抗体具有较大的 免疫原性，易产生不良反应。单克隆抗体经人源化改造后，能够解决以上问题。因此抗AGR2 人源化单克隆抗体具有成为潜在抗肿瘤药物的前景。
[0005] 中国仓鼠卵巢细胞（CH0)是较为成熟的表达外源蛋白的哺乳动物细胞系，具有多 年的实践运用经验。CH0细胞易于大规模培养，外源基因易于稳定整合入细胞的基因组，在 表达外源蛋白中具有较大优势。
[0006] 筛选稳定表达单克隆抗体的CH0细胞株，目前有多种方式报道，如共转染带有抗 性的载体、转染营养缺陷性的细胞株、基于荧光的可视化筛选系统等。抗性筛选系统包括 G418抗性、嘌呤霉素抗性等。绿色荧光蛋白作为可视化筛选系统的代表有着广泛的应用，如 转染pEGFP载体（美国专利，No. 5625048)可将目的基因与绿荧光蛋白EGFP融合表达，通 过观察可以根据绿荧光的强弱有选择性的确定目的蛋白的表达高低。通过将抗性筛选系统 和绿色荧光蛋白的可视化筛选系统整合，组合成筛选标签，则综合了两者的优势。
[0007] 但是，可视化筛选系统的不足在于，绿色荧光蛋白不是目标产物，可能影响目标蛋 白的表达效率，同时绿色荧光蛋白也属于杂质，需要通过合适的方法予以去除。现有的去除 绿色荧光蛋白的方法，如Cre重组酶系统等，需要在稳定细胞株上另外转染质粒，存在引入 外源质粒的风险。能否不通过另外转染质粒，就达到除去细胞株中绿色荧光蛋白的目的，是 可视化筛选系统急需解决的问题之一。
[0008] 综上所述，AGR2是潜在的肿瘤治疗靶标，抗AGR2人源化单克隆抗体解决了鼠源抗 体免疫原性的问题，具有成为潜在抗肿瘤药物的前景。抗AGR2人源化抗体的表达和制备成 为需要突破的技术问题，也是抗AGR2人源化抗体成为候选抗肿瘤药物的必要条件。CH0细 胞具有表达外源蛋白的优势，且易于大规模培养。抗性筛选系统与基于荧光的可视化筛选 系统整合而成的筛选标签综合了两者的优势，有利于稳定细胞株的筛选。筛选完成后，需 要解决不通过另外转染质粒而除去绿色荧光蛋白。因此，开发CH0细胞株能够稳定表达抗 AGR2人源化单克隆抗体具有良好的应用前景和经济价值，并能解决上述技术问题。
[0009] 目前，现有技术中尚无能够稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CH0细胞株报 道，也没有将CH0细胞株用于抗AGR2人源化单克隆抗体制备的应用报道。
【发明内容】
[0010] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种稳定表达抗AGR2人 源化单克隆抗体的CH0细胞株及其应用，用于解决现有技术中的问题。
[0011] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种稳定表达抗AGR2 人源化单克隆抗体的CH0细胞株，所述细胞株的名称为：中国仓鼠卵巢细胞CH0-S/ K70E10-1D6,所述细胞株的保藏号为：CCTCCNO:C2014189。
[0012] 该细胞株已于2014年10月10日在中国典型培养物保藏中心（地址：武汉市 武汉大学）注册保藏，保藏号为CCTCCN0:C2014189,名称为：中国仓鼠卵巢细胞CH0-S/ K70E10-1D6。
[0013] 本发明所述的CH0细胞株，能够稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体，具体为该细 胞株能够分泌表达抗AGR2人源化单克隆抗体到细胞培养上清液中，所分泌的抗体能够通 过酶联免疫吸附法（ELISA)检测。该细胞株在细胞数倍增1-40次后，抗体的表达水平稳定， 即在相同的培养条件下，细胞数倍增1-40次后，通过酶联免疫吸附法（ELISA)检测，细胞培 养上清液中抗体浓度保持在l_5mg/L。
[0014] 本发明所述的稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CH0细胞株，其宿主细胞为 CH0-S细胞，带有绿色荧光和嘌呤霉素抗性作为筛选标签，该筛选标签能够通过转染DNA片 段ereplasmid-free的方法删除；基因组中带有能够被确认的特征序列。
[0015] 具体来说，所述绿色荧光标签能够在荧光显微镜下显著地观察到；通过流式细胞 仪的FITC-H通道检测，处于对数生长期的该细胞株的绿色荧光强度与宿主细胞CH0-S有显 著的差异。通过转染序列为SEQNo. 1的DNA片段ereplasmid-free,能够除去该细胞株的 绿色荧光蛋白。该细胞株基因组中带有的如SEQNo. 2所示的特征序列能够用PCR法进行 扩增，并用测序的方法予以确认。
[0016] 本发明第二方面提供所述细胞株在制备抗AGR2人源化单克隆抗体中的应用。
[0017] 本发明所述的CH0细胞株能够运用于抗AGR2人源化单克隆抗体的制备，使用无血 清培养基长时间培养该细胞株，通过酶联免疫吸附法（ELISA)、HPLC检测，细胞培养上清液 中抗体表达浓度可达l〇-l〇〇mg/L。使用亲和纯化的方式，能够从细胞培养上清液中纯化抗AGR2人源化单克隆抗体。
[0018]本发明第三方面提供一种抗AGR2人源化单克隆抗体，由保藏号为CCTCCN0:C2014189的CH0细胞株或其传代细胞株分泌产生。
[0019] 本发明所述的CH0细胞株K70E10-1D6制备的抗AGR2人源化单克隆抗体能够与 AGR2特异性结合，并能够被免疫印迹法（WesternBlot)检测，通过竞争性ELISA法检测，该 抗体与AGR2的亲和力为9. 09X108L/mol。
[0020] 本发明第四方面提供所述稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CH0细胞株和所 述抗AGR2人源化单克隆抗体在制备检测试剂或诊断试剂中的应用。
[0021] 本发明第五方面提供所述稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体的CH0细胞株和所 述抗AGR2人源化单克隆抗体在制备或筛选肿瘤治疗药物中的应用。
[0022] 优选的，所述肿瘤为乳腺癌。
[0023] 如上所述，本发明所提供的抗AGR2人源化单克隆抗体的CH0细胞株K70E10-1D6 能够稳定表达抗AGR2人源化单克隆抗体，且制备获得的抗AGR2人源化单克隆抗体能够与 AGR2特异性结合，亲和力高达9. 09X108L/mol，并能够抑制乳腺癌细胞MCF7的生长。
【附图说明】
[0024] 图1是CH0细胞株K70E10-1D6每一代的第2天细胞密度曲线；
[0025] 图2是CH0细胞株K70E10-1D6每一代的第2天时的抗体表达量曲线；
[0026] 图3是CH0细胞株K70E10-1D6的细胞倍增次数-抗体表达量曲线；
[0027] 图4是CH0细胞株K70E10-1D6的放大100倍的荧光照片；
[0028] 图5是CH0细胞株K70E10-1D6和CH0-S细胞用流式细胞仪的FITC-H通道检测绿 色荧光；
[0029] 图6是通过PCR扩增DNA片段ereplasmid-free的琼脂糖凝胶电泳图；
[0030] 图7是CH0细胞株K70E10-1D6转染DNA片段ereplasmid-free前和转染24小 时后的灭光照片；
[0031] 图8是通过PCR扩增CH0细胞株K70E10-1D6基因组的特征序列片段；
[0032] 图9是CH0细胞株K70E10-1D6的长时间培养时不同时间点的细胞密度曲线和对 应的抗体表达量；
[0033] 图10是CH0细胞株K70E10-1D6上清液在ProteinA和ProteinG纯化时各阶段 液体中抗体浓度的检测；
[0034] 图11 (a)是使用ProteinA-HPLC检测K70E10-1D6培养液中的抗体浓度结果，图 11(b)是人源化单克隆抗体的标准品的拟合直线；
[0035] 图12是CH0细胞株K70E10-1D6表达的抗体与AGR2结合的免疫印迹检测；