一种猪促卵胞激素α-亚基的编码基因FSHα及其筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体的涉及一种猪促卵胞激素a-亚基的编码基因 FSHa及其筛选方法。
【背景技术】
[0002] 促卵泡激素，亦称为卵泡刺激素（Follicle-StimulatingHormone,FSH)，因最早 发现其对雌性动物卵泡成熟的刺激作用而得名。促卵泡激素是动物垂体前叶嗜碱性细胞 合成和分泌的一种糖蛋白类促性腺激素，与促黄体激素、促甲状腺激素、及胎盘产生的绒毛 膜促性腺激素共同组成一个糖蛋白激素家族。它们的功能各异，结构却极为相似，都是由 a-亚基和亚基所组成。在同一物种内a-亚基是确定的，它们的a-亚基可以互换， 而亚基不能互换，亚基具有激素各自的特异性，又具有种间特异性，是激素生物活 性和免疫活性的决定因素。a-亚基和亚基单独都不具有生物活性，只有当两者结合 在一起引起立体结构上的变化，才具有生物活性。一般认为，亚基负责信号传导作用， 3 -亚基是功能亚基，参与受体结合。后经研究发现，a-亚基和@ -亚基均参加受体结合 和信号传导作用。它对雌性动物卵泡生长发育尤其对窦状卵泡发育成熟起着至关重要的作 用。促卵泡激素可在绝经期女性的尿液中提取得到，也可以通过基因工程的方法重组表达 得到。临床主要用于对不孕症患者的治疗，用以刺激卵泡的发育成熟，同时也用于体外人工 受:精和体内人工受:精的相关治疗中。
[0003] 太湖猪高产仔数的物质基础是高的排卵率和良好的子宫容量。而在卵泡发育和排 卵过程中，FSH和LH是两种起直接作用的糖蛋白激素，其中FSH应用于超排的研究已证明高 浓度的FSH可以促进更多的卵泡成熟，在LH协同作用下，实现超排。近年来，在鼠、羊、牛等 许多动物中，对抑制素免疫所引起的排卵率的变化最终也归因于FSH浓度的上升。研究发 现首次发情周期内，太湖猪循环血液中FSH浓度显著高于其它猪种。因此，FSH被当作控制 太湖猪高排卵率的候选基因。陈杰等采用PCR-SSCP作为遗传标记，对二花脸猪FSH0 -亚 基基因位点和产仔数性状的关系进行了研究，他们发现该标记位点与二花脸猪的产仔数性 状显著相关，PCR-SSCP标记基因型的不同可以导致猪的产仔数有显著差异。
[0004] 我国是世界第一养猪大国，无论从经济方面考虑还是从环境方面考虑，在保证需 求的同时，减少母猪的饲养量，提高母猪的繁殖性能，具有重要的理论和实践意义。如何提 高母猪繁殖能力一直是困扰畜牧工作者的一个难题。母猪的年生产力主要由产仔数、仔猪 存活率及产仔间隔所决定。但繁殖性状的遗传力低、性状表现晚、而且是限性遗传，受环境 因素影响很大，所以在过去，通过常规育种手段进行选育取得了一些进展，但进展缓慢，至 今停滞不前，达到所谓的"选择高原"。据报道，法国用30多年的时间来改良猪产仔数性状， 但进展甚微；丹麦将产仔数提高1头用了 50多年。
[0005] 因此，有必要利用最新的分子生物学技术，从基因水平着手，获得繁殖力高的转基 因猪。以后在猪中与生殖及其产仔数的功能研究和未来转基因育种打下重要基础。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于通过构建二花脸猪基因组BAC文库，筛选获得猪促卵胞激素 a_亚基的编码基因FSHa，从而将该基因应用于转基因克隆猪的构建提高母猪产仔数。
[0007]本发明提供了一种猪促卵胞激素a-亚基的编码基因FSHa，所述基因的核苷酸 序列如SEQIDNO: 1所示。
[0008] 本发明提供了一种基因FSHa的筛选方法，所述方法包括以下步骤：
[0009] (1)构建二花脸猪基因组BAC文库：采二花脸公猪静脉血制备核DNA，酶切后获得 核DNA片段；将所述核DNA片段与载体连接后点击转化感受态菌获得二花脸猪基因组BAC 文库；
[0010] (2)从所述BAC文库中筛选获得包含SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列的BAC克隆；
[0011] 利用筛选引物对二花脸猪基因组BAC文库超级池进行PCR扩增，筛选出阳性克隆 作为BAC文库二级池；再次利用所述筛选引物对BAC文库二级池进行PCR扩增，筛选出含有 SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列的BAC克隆；
[0012] 其中所述筛选引物为：
[0013]pFSHa249-UP:GCCCAGAATGCAAGCTAAAG(SEQIDN0 :2 所示的序列）。
[0014]pFSHa249-D0WN:GATGTGCTCTGGGGACAITT(SEQIDN0 :3 所示的序列）。
[0015] 可选的，所述PCR扩增的反应体系为：
[0016]
【主权项】
1. 一种猪促卵胞激素a -亚基的编码基因FSH a，其特征在于，所述基因的核巧酸序列 如 SEQ ID NO: 1 所示。
2. 权利要求1所述的基因F甜a的筛选方法，其特征在于，所述方法包括W下步骤： (1) 构建二花脸猪基因组BAC文库；采二花脸公猪静脉血制备核DNA，酶切后获得核 DNA片段；将所述核DNA片段与载体连接后电击转化感受态菌获得二花脸猪基因组BAC文 库； (2) 利用筛选引物对二花脸猪基因组BAC文库超级池进行PCR扩增，筛选出阳性克隆 作为BAC文库二级池；再次利用所述筛选引物对BAC文库二级池进行PCR扩增，筛选出含有 SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序列的BAC克隆； 其中所述筛选引物为： pF甜 a 249-UP:GCCCAGAATGCAAGCTAAAG pF甜 a 249-D0WN:GATGTGCTCTGGGGACATTT。
3. 根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：
4. 根据权利要求2或3所述的筛选方法，其特征在于，所述PCR反应的程序为 94C 5min ;94°C 30sec，62°C 30sec，72°C 120sec，30 个循环；72C 7min〇
5. 含有权利要求1所述基因FSH a的重组表达载体。
6. 含有权利要求1所述基因F甜a的工程菌。
7. -种构建猪促卵胞激素a -亚基表达量增强的转基因克隆猪的方法，其特征在于， 所述方法包括在转基因克隆猪体内表达猪促卵胞激素a-亚基的编码基因F甜a。
【专利摘要】本发明涉及一种猪促卵胞激素α-亚基的编码基因FSHα，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明通过构建二花脸猪基因组BAC文库，获得猪促卵胞激素α-亚基的编码基因FSHα全基因序列，并构建BAC真核表达载体，利用本发明所提供的方法构建的转基因猪可以进一步应用于与猪生殖及其产仔数的功能相关的研究，提高饲养动物产仔数。
【IPC分类】A01K67-027, C07K14-59, C12N15-16, C12N15-85
【公开号】CN104593376
【申请号】CN201410854498
【发明人】李宁, 李秋艳, 王明, 孙照霖, 康倩倩
【申请人】中国农业大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2014年12月31日