柔嫩艾美耳球虫配子体抗原gam59基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及柔嫩艾美耳球虫（Eimeriatenella)的配子体抗原基因，由所述基因 编码的多肽，含有所述基因的载体以及所述基因的获取方法和多肽的体外表达方法以及功 能鉴定。具体地，本发明的基因来自于鸡柔嫩艾美耳球虫有性生殖阶段的配子体。
【背景技术】
[0002] 鸡球虫病是由艾美耳属的一种或数种球虫寄生在鸡小肠或盲肠黏膜内引起的严 重危害养鸡业的原虫病，估计每年全球因球虫病的损失为30亿美元。我国每年仅抗球虫药 的年消费就约6?18亿元人民币，由鸡球虫病造成的直接和间接经济损失则难以估计。长 期以来，鸡球虫病的防治主要依赖药物。但由于球虫对药物普遍产生了耐药性，引起药效下 降。而且在鸡饲养周期中长期添加药物还导致药物残留肉蛋，直接危害人类健康，并污染环 境。为此，鸡球虫病的防治方法由化学预防转向了免疫预防。
[0003] 目前，临床上用于免疫预防鸡球虫病的疫苗有活虫苗和由天然蛋白组成的亚单位 疫苗两大类。鸡球虫病活疫苗虽然有着较强的免疫效果，但存在着如扩散病原的风险、球虫 虫株的抗原变异、致弱虫株毒力易返强、疫苗接种剂量难以控制、疫苗影响饲料报酬、生产 成本高、免疫程序繁琐、操作和免疫后的监测和管理技术要求高等一些突出的问题。商品化 的鸡球虫病亚单位疫苗是由来源于巨型艾美耳球虫配子体的三种纯化抗原（分子质量分 别为230、82、56kDa)配制而成，用于干扰卵囊壁的形成，即阻断艾美耳球虫的有性生殖阶 段，从而降低卵囊的产生与传播。由于该类疫苗的抗原需从配子体蛋白中经亲和柱分离纯 化，配子体又需从感染鸡体的肠道上皮细胞中分离纯化，因此生产工艺复杂，成本高，难易 满足生产需求。而利用基因工程技术大量生产该类抗原，可能是解决这一问题的最佳策略。 但巨型艾美耳球虫配子体抗原Emgam82和Emgam56基因已受到专利保护，而且鸡球虫的免 疫具有种特异性，即一种球虫免疫后产生的免疫力仅对同种球虫感染有抱保护力。
[0004] 柔嫩艾美耳球虫是鸡球虫病的主要病原，主要危害15?50日龄的鸡。从柔嫩艾 美耳球虫分离鉴定的功能性抗原主要来自子孢子、裂殖体、裂殖子等发育阶段，其中有些蛋 白定位于虫体的细胞膜、微线体、棒状体与折光体等结构上，主要包括S07、MZ5-7、TA4(A4)、 GX3262、3-1E、EtMic2和LDH等基因。迄今为止，文献报道的柔嫩艾美耳球虫配子体全 长基因仅见Etmgam22基因，该基因含有一个597bp的开放阅读框，为一种不内含子的多 拷贝基因。同时，国外文献也证实在柔嫩艾美耳球虫中存在两种巨型艾美耳球虫配子体 Emgam56基因的同系物，分别为Etgam56和Etgam59,但其核苷酸序列尚无报道。柔嫩艾美 耳球虫配子体Etgam22、Etgam56和Etgam59基因的功能与巨型艾美耳球虫配子体Emgam56 和Emgam59基因相同，其编码的蛋白用于卵囊壁的形成。因此，柔嫩艾美耳球虫配子体 Etgam22、Etgam56和Etgam59基因可以用于构建基因工程疫苗，防治柔嫩艾美耳球虫引发 的球虫病。
【发明内容】
[0005] 本发明利用基因工程技术，克隆柔嫩艾美耳球虫配子体抗原基因Etgam59,并将该 基因转入工程菌进行表达，获得大量的重组抗原，并对重组抗原的特异性、免疫原性等进行 深入研宄，旨为研制鸡球虫重组配子体抗原疫苗奠定基础。
[0006] 本发明涉及柔嫩艾美耳球虫的一种配子体抗原基因，其中，所述基因的开放阅读 框为1617bp，其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0007] 其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0008] 去除信号肽（前22个氨基酸）以后的序列如SEQIDNO. 3所示。
[0009] 本发明涉及到一种表达载体pET28a，其含有所述配子体抗原基因。将分离得 到的配子体抗原基因插入酶切位点，连接到原核表达载体pET28a中，常规转化大肠杆菌 BL21 (DE3)，构建基因工程菌，并诱导表达，对表达产物进行分离和纯化。
[0010] 此外，本发明涉及一种真核表达载体pcDNA3. 1，其含有所述配子体抗原基因。将分 离得到的Etgam59基因插入酶切位点，连接到pcDNA3. 1中，构建成pcDNA3. 1-Etgam59真核 重组质粒，免疫小鼠获得多克隆抗体；以此鼠多抗为一抗，以原核表达的Etgam59重组蛋白 为抗原进行Western-blot检测，鉴定真核质粒表达的Etgam59重组蛋白的免疫原性。
[0011] 作为优选的方案，具体操作是：
[0012] 1)从柔嫩艾美耳球虫配子体基因中分离Etgam59基因：
[0013] 常规方法分离纯化柔嫩艾美耳球虫配子体，用RNA提取试剂盒提取总RNA。设计特 异性引物：
[0014] 上游引物：5' -CCCCGGGAACATGACTCGTCTCGCCGCC-3'（SEQIDNO. 4);
[0015]下游引物：5' -CGAAITCTTACTCAAATCCAAAAGAAGG-3'（SEQIDNO. 5)。
[0016] 以配子体总RNA反转录得到的cDNA为模板，经过PCR条件的反复优化后，成功 扩增出与预期结果相符且大小为1617bp左右的特异性片段（图1)，命名为Etgam59。 将含有目的片段PCR产物经试剂盒纯化回收后，克隆到pGEM-T-easy载体中，得到 pGEM-T_easy-Etgam59 〇
[0017] 2)原核表达载体的构建
[0018] 根据柔嫩艾美耳球虫Etgam59基因的0RF序列和质粒pET-28a酶切位点，去除 Etgam59基因的信号肽后，设计1对特异性引物：
[0019] 上游引物F:5' -CCGGAAITCATGCCCACGGCCATCCCC-3'（SEQIDNO. 6)，含EcoRI酶 切位点和3个保护性碱基，
[0020] 下游引物R:5' -CCGAAGCTTTTACTCAAATCCAAAAGA-3'（SEQIDNO. 7)，含HindIII酶 切位点和3个保护性碱基。
[0021] 以构建的pGEM-T-eaSy-Etgam59载体为模板，成功扩增出与预期结果相符且大 小为1569bp左右的特异性片段（图2)，并将此片段连接到原核表达载体pET28a中，得到 pET28a_Etgam59。
[0022] 3)柔嫩艾美耳球虫Etgam59基因的高效表达与纯化
[0023] 将构建好的原核表达载体pET28a-Etgam59转化BL21宿主菌，IPTG诱导表达后，经 过可溶性分析，发现此体外重组表达的蛋白以可溶性蛋白的形式存在（图3)。重组蛋白的 大量表达时，超生裂解释放的可溶性蛋白通过含有HIS标签的Ni-NTA亲和层析纯化后，在 pH值为8. 0的PBS中透析8h，最终通过PEG8000浓缩，收集蛋白，12 %SDS-PAGE分析（图 4)，4°C保存。
[0024] 4)体外重组表达蛋白的特异性和免疫原性检测
[0025] 分别以抗HIS的单克隆抗体（图5)、鼠抗Etgam59的多克隆抗体（图6)和柔嫩艾 美耳球虫卵囊三次免疫后鸡的康复血清（图7)为一抗，用western-blot方法检测重组蛋 白的特异性和免疫原性。
[0026] 本发明还公开了所述Etgam59基因在构建核酸疫苗中的应用。
[0027] 所述核酸疫苗的构建如下：
[0028] 根据Etgam59基因的0RF序列和pcDNA3. 1的特性，设计1对特异性引物：上游引 物F1 :5' -CCGAAGCTTATGCCCACGGCCATCCCC-3'（SEQIDNO. 8)，含HindIII酶切位点和 3 个 保护性碱基；下游引物R1 :5' -CCGGAAITCTTACTCAAATCCAAAAGA-3'（SEQIDNO. 9)，含EcoR I酶切位点和3个保护性碱基。
[0029] 以构建的pGEM-T-eaSy-Etgam59载体为模板，成功扩增得到与预期结果相符大 小为1569bp左右的特异性片段（图8)，并将该目的片段连接到质粒pcDNA3. 1中，得到 pcDNA3. 1-Etgam59。
[0030]将构建的重组质粒pcDNA3. 1-Etgam59进行EcoRI和Hind III双酶切鉴定（图9)， 选择阳性克隆株测序，确定阅读框正确后大量克隆用于后续试验。
[0031] 核酸疫苗的免疫原性分析
[0032] 鼠抗重组质粒pcDNA3. 1-Etgam59多克隆抗体的制备：取6?8周龄BALB/c雌 鼠6只，肌肉注射0. 75%利多卡因50y1/只辅助扩散，24h后在相同部位注射重组质粒 pcDNA3. 1-Etgam59 100yg/只。此后第2周第3周各加强免疫一次，操作与剂量不变。3 次免疫后第10天摘眼球取血，37°C静置30min，4°C静置4h，2500rpm离心15min，收集分离 血清，用于western-blot检测原核表达的Etgam59重组蛋白抗原，鉴定核酸疫苗的免疫原 性（图10)。
【附图说明】
[0033] 图1是柔嫩艾美耳球虫Etgam59基因整个0RF扩增结果。其中1:标准分子量；2 和3是扩增得到的目的片段，大小为1617bp。