一种鲫鱼疱疹病毒病jdorf25疫苗及制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种鲫鱼疱疹病毒病疫苗（JD0RF25)及制备方法 和应用。
【背景技术】
[0002] 鲤疱疫病毒II型（Cyprinid herpesvirus II，CyHV-2)感染异育银鲫是近年新出 现的一种严重病毒性疾病，已经造成重大经济损失。鲤疱疹病毒II型最早在观赏金鱼中发 现，称为"金鱼疱疹病毒性造血器官坏死症"。该病毒因其是第二个分离自鲤科鱼的疱疹病 毒，国际病毒系统分类与命名委员会将其命名为鲤疱疹病毒II型（CyHV-2)。CyHV-2与鲤 痘疮病毒（Car p pox herpesvirus, Cyprinid herpesvirus I，CyHV-1)及锦鲤疱疫病毒 (Koi herpesvirus, Cyp rinid herpesvirus3，CyHV_3)的关系接近，属于鲤疱疫病毒科成 员，目前CyHV-2的全基因组测序与注释研究已经完成，对CyHV-2重要功能基因的研究正陆 续展开，但对病毒疫苗制备方面研究相对较少。CyHV-2 0RF25是一个重要的免疫相关基因， 存在一个跨膜结构域，是制备预防鲫鱼疱疹病毒病疫苗的重要靶基因。本发明通过对鲤疱 疹病毒II型0RF25基因编码蛋白进行分析，选择亲水性和抗原性强的区域表达制备疫苗。
[0003] 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)是一种新型真核表达系统，能稳定高效表达 外源蛋白，并能对表达产物进行翻译后加工和修饰，同时，其成熟的高密度发酵技术为目的 蛋白的工业化生产提供了保障。自1984年应用毕赤酵母表达外源蛋白以来，已有400多种 蛋白在该系统中成功表达，部分成果已进入商品化生产。
[0004] 由于遗传密码具有简并性，一种氨基酸可以有1-6个使用频率不同的同义密码 子。对于特定的物种，高表达的基因往往使用部分特定的同义密码子，这些密码子被认为是 该物种高表达基因的优越密码子，这种现象称为密码子偏爱性。密码子的偏爱性使得克隆 的外源基因往往难以在异种生物细胞高效表达。在酵母中获得高效表达的外源基因往往 都是酵母偏爱密码子所编码的基因，通过对酵母基因使用密码子的统计分析证实所有的61 个密码子中有25个是酵母所偏爱的，因此对密码子进行偏爱性改造能大量提高重组蛋白 在该系统中的表达量。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供了一种鲫鱼疱疹病毒病疫苗，该疫苗为将鲤疱疹病毒II型 免疫相关0RF25基因截短优化后翻译的重组蛋白JD0RF25,其序列为SEQ ID N0. 2所示，对 应的核苷酸序列为SEQ ID NO. 1所示。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供了一种鲫鱼疱疹病毒病疫苗的制备方法，申请人提 供了一株巴斯德毕赤酵母 Km71/CyHV-2_25 Pichia pastoris Km71/CyHV-2_25 菌株，该菌 株包含有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，将该菌株发酵可制备鲫鱼疱疹病毒病疫苗。该菌 株已于2014年11月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO :M2014570， 分类命名：巴斯德毕赤酵母 Km71/CyHV-2-25 Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25,地址：中 国武汉武汉大学。
[0007] 本发明的最后一个目的在于提供了一种鲫鱼疱疹病毒病疫苗在制备鲤疱疹病毒 II型疫苗中的应用。
[0008] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
[0009] -种鲫鱼疱疹病毒病疫苗的获得：
[0010] 分析Genbank公布的鲤疱疹病毒II型免疫相关0RF25基因（JQ815364. 1)，找到亲 水性和抗原性强的区域，按酵母密码子偏好性进行优化，合成该基因片段，其序列为SEQ ID NO. 1所示，根据优化片段的基因序列设计引物（JD0RF25 IF和JD0RF25 1R)进行PC R反 应，克隆获得截短优化的0RF25基因，转入酵母表达载体，获得重组表达载体，然后再将其 导入酵母表达菌种，筛选高拷贝克隆，获得重组毕赤酵母表达菌，该菌株已于2014年11月 18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC N0:M2014570,分类命名：巴斯德毕 赤酵母 Km71/CyHV-2-25 Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25,地址：中国武汉武汉大学。
[0011]上述巴斯德毕赤酵母 Km71/CyHV-2-25 Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25 CCTCC N 0 :M2014570的菌学特征为：该酵母菌是单细胞真核生物，椭圆形，不运动，营养细胞为单 体，可在含有2mg/mL Zeocin抗生素的YPDS平板上培养，液体培养条件下以单细胞形式存 在，固体培养时。呈菌落存在，菌落表面湿润、光滑、为乳白色。依次通过BMGY和BMMY培养 基培养后，上清液中含有鲤疱疹病毒II型JD0RF25蛋白。
[0012] 上述巴斯德毕赤酵母Km71/CyHV-2-25 Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25 的构建 方法具体为：
[0013] 1)合成SEQ ID NO. 1所示为JD0RF25基因的核苷酸序列。
[0014] 2)引物设计
[0015] JD0RF25 1F :5' -CGGAATTCCGACTCAAAACACTACTACTAC-3' (含 EcoR I 酶切位点）
[0016] JD0RF25 1R :5' -TCCCCGCGGCGTTAGCACCGTATGGAGTAG-3' (含 Sac II 酶切位点）。
[0017] 3) PCR 获取 JD0RF25 基因
[0018] 以JD0RF25 1F/JD0RF25 1R为引物，优化合成的JD0RF25基因为模板进行PCR，回 收PCR产物。
[0019] 4)将获取的目的基因克隆入pPICZa B表达载体并进行序列测定
[0020] PCR产物和pPICZa B均用EcoR I、Sac II双酶切，T4 DNA连接酶连接，连接产 物转化E. coli DH5a感受态细胞，从含25iig/mL Zeocin的LB平板上挑取单克隆，小量 提取质粒，用酵母特异引物 5' -A0X (5' -GACTGGITCCAAITGACAAGC-3'）和 3' -A0X (5' -GCA AATGGCAITCTGACATCC-3'）进行 PCR 鉴定，同时进行 Sac II 单酶切，EcoR I、Sac II 双酶切 鉴定。阳性连接产物命名为：pPICZaB-CyHV-2-25。
[0021] 5)电转酵母菌及转化子的筛选
[0022] 重组质粒pPICZ a B-CyHV-2-25经Sac I酶切线性化后，异丙醇沉淀回收，同时酶 切空载体设为对照。酵母KM71感受态细胞的制备参考EasySelect Pichia expression kit user m anual, Invitrogen。将10 u L线性化的重组质粒（约6 u g)与80 u L酵母感 受态细胞混合，转移至预冷的〇. 2cm电转杯中，置冰上5min，1. 5kV电击6. 8毫秒后，立即加 入lmL预冷的lmol/L山梨醇，30°C复苏2h，取菌液200 y L涂布在含100 y g/mL Zeocin的 YPDS平板上，30°C培养2?4天，直单克隆出现。
[0023] 从含有100 ii g/mL Zeocin的YPDS抗性平板上随机挑取单克隆，按酵母基因组DNA 提取试剂盒（OMEGA)操作说明提取重组酵母DNA进行PCR鉴定，所用引物为酵母通用引物 A0X I。对鉴定后的重组酵母-80°C保存，对鉴定后的重组酵母_80°C保存。
[0024] 转化子高拷贝筛选：取出冻存的阳性转化子，在无抗性的YH)液体培养中活化。将 200 y L菌液涂布于Zeocin抗生素浓度逐渐升高（0? 5mg/mL，lmg/mL和2mg/mL)的YPDS平 板上，30°C培养2?5d，每天观察菌落生长情况。挑取在高浓度平板上生长较快且颗粒饱 满的单克隆在YH)平板上划线纯化，即得重组毕赤酵母表达菌，该菌株已于2014年11月 18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC N0:M2014570,分类命名：巴斯德毕 赤酵母 Km71/CyHV-2-25 Pichia pastoris Km71/CyHV-2-25,地址：中国武汉武汉大学。6) 重组酵母菌的诱导表达及产物鉴定
[0025]将毕赤酵母 Km71/CyHV-2-25 接种到 100mL BMGY 培养基中，30°C、250r/min 振荡 培养至0D_值达6左右，室温1500g离心5min，20mL BMMY培养基重悬菌体，所得菌液转入 100mL的摇瓶，封瓶膜封口，加入100%甲醇至终浓度0. 5%，于30°C、250r/min的条件下诱 导培养，每24h补加甲醇，使甲醇浓度维持0. 5%。连续诱导3天后，通过离心去除诱导液中 的酵母菌（去除沉淀，留上清），上清经过低温冷冻干燥和his纯化的方式进行浓缩纯化，即 得鲫鱼疱疹病毒病疫苗重组蛋白JD0RF25,蛋白序列为SEQ ID N0. 2所示。
[0026] -种鲫鱼疱疹病毒病疫苗在制备鲤疱疹病毒II型疫苗中的应用，将该疫苗直接注 射于鲫鱼体内，或与其他疫苗佐剂混合，可起到抗鲤疱疹病毒II型的效果。
[0027] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0028] 1.毕赤酵母曾作为单细胞蛋白广泛应用，本身就具有很好的安全性，并且酵母培 养基中不含有毒物质和致热源；
[0029] 2.本发明生产的疫苗抗原是中和性抗原蛋白，而不是灭活或者减毒的鲤疱疹病毒 II型，因此该疫苗安全可靠；
[0030] 3.本发明涉及的疫苗用抗原是蛋白质，与其他新型疫苗（如活载体疫苗、核酸疫 苗、基因缺失疫苗）相比不会发生可能出现的基因重组问题，因此本发明不存在生物安全 性问题。
[0031] 4.本发明以酵母作为目的蛋白的表达载体，培养简单，可以用发酵罐规模化生产， 可以实现质量控制，保证所生产的疫苗安全有效；
[0032] 5.本发明以酵母作为目的蛋白的表达载体，与大肠杆菌原核表达相比，表达量要 高，其活性要远高于包涵体蛋白。酵母表达系统是一种简单的真核表达系统，能稳定高效表 达外源蛋白，并能对表达产物进行翻译后加工和修饰，同时，其成熟的高密度发酵技术为目 的蛋白的工业化生产提供了保障，因此采用鲤疱疹病毒II型免疫相关0RF25基因截短优化 后翻译的重组蛋白（JD0RF25)为亚单位疫苗可以完全