一种重组合胞病毒蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程、疫苗研制和诊断试剂等领域，具体地涉及一种重组合胞病 毒蛋白、表达该蛋白的基因及其应用。
【背景技术】
[0002] 呼吸道合胞病毒（respiratorysyncytialvirus,RSV)简称合胞病毒，又称融合 病毒，是一种RNA病毒，属副黏病毒科肺炎属。病毒颗粒呈圆形，大小不一，直径为100? 300nm。核心为单股RNA，外有核壳，最外一层为带有刺状突起的包膜。因不含血凝素，故无 血凝作用。病毒能在人体呼吸道细胞和人肾、猴肾等细胞培养中生长，并产生病变。只有一 个血清型，可分4个亚型。抵抗力弱，不耐乙醚、酸、热及冻融，pH3以下和55°C五分钟即可 灭活。
[0003] 流行病学 RSV是婴幼儿呼吸道感染，尤其是毛细支气管炎(简称毛支）的主要病原体。感染后主 要表现为毛细支气管炎和肺炎，占2岁以下婴幼儿住院中的45%。越来越多的流行病学资料 显示，婴幼儿期的毛细支气管炎是日后儿童哮喘的高危因素。
[0004]RSV感染呈世界性分布，最新的研究发现免疫功能缺陷的成年人及老年人也是 RSV的易感人群。
[0005]RSV感染后不存在保护性免疫，再感染的发生率很高，每年约有100万人死于RSV 感染，美国每年约花费22. 5亿美元用于治疗RSV感染。
[0006]RSV的蛋白组成： RSV属副粘病毒科肺炎病毒属，其基因组为不分节的线性负链RNA，约含15 000个核 苷酸，共有10个不同的基因，编码10个病毒蛋白。从3'一 5'，其基因的排列顺序为为NS1 一NS2 -N-P-M-SH-G-F-M2 -L。似乎所有蛋白是通过一共同的开放读码框架翻译 的。10个蛋白中8个为结构蛋白，即大糖蛋白G、融合糖蛋白F，与包膜相连的基质蛋白M和 M2 (亦称22*103蛋白）、核蛋白N、磷酸化蛋白P、大蛋白L和小疏水蛋白SH(以前称为1A)， 另12个蛋白为非结构蛋白NS1和NS2(前分别称为1C和11B).除F、G和SH外.其求均不 糖基化.SH有4种形式，分子量分别为4. 8X103、7. 5X103、15X103和21X103~30X103， 后两种形式糖基化。M基因和M2基因中均另有一个开放读码框架，分别编码75个氨基酸和 990个氨基酸的蛋白质，因而设想可能存在第11和第12种病毒蛋白，但至今未分离成功。
[0007]相关的临床或实验室诊断方法： 检测呼吸道合胞病毒感染，目前国内外多采用病毒分离培养法、间接免疫荧光法（IF)、 直接免疫荧光法、碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶标法（APAAP)、生物素链霉亲和素过氧化 物酶法、酶联免疫吸附试验（EusA)、病毒快速检测法、分子生物学法，如多重逆转录聚合酶 链反应（mRT-PCR)、巢式PCR及核酸杂交、多重实时PCR、基因芯片技术、悬浮阵列技术等多 种检测手段。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种重组合胞病毒蛋白及该重组合胞病毒蛋白在制备检测 试剂盒中的应用。
[0009] -种重组合胞病毒蛋白基因况其核苷酸序列如序列表SEQIDNO. 1所不。
[0010] 一种重组合胞病毒蛋白基因韵制备方法： 以合胞病毒培养物为模板，以引物P1和P2扩增合胞病毒基因组中第628位到第999 位核苷酸片段，以引物P3和P4扩增第1140位到第2312位核苷酸片段；再以第一轮PCR扩 增得到的两片段为模板，加入引物P1和P4,扩增rRSV-58片段；得到串联的目的基因重组 片段 PI ：CGCGGATCCATGGACACACACAATGACACC； P2：CTTGACTTTGCTAAGAGCCATTGGATTGAGATCATACTTGTATATTATGG； P3：CCATAATATACAAGTATGATCTCAATCCAATGGCTCTTAGCAAAGTCAAG； P4:CCGCTCGAGAAGCTCTACATCATTATCTTTTGG。
[0011] 一种重组合胞病毒蛋白rRSV-58,其氨基酸序列如序列表SEQIDNO. 2所示。
[0012] -种重组合胞病毒蛋白的表达载体，它是在表达载体中插入了如序列表SEQID NO. 1所示的基因 所述的载体为pET-28a。
[0013] 一种重组合胞病毒蛋白的工程菌，它是转染了上述的一种合胞病毒蛋白的表达载 体的大肠杆菌； 所述的大肠杆菌为BL21 (DE3)。
[0014] 一种重组合胞病毒蛋白的制备方法，将一种重组合胞病毒蛋白的表达载体转染至 大肠杆菌为BL21 (DE3)中，诱导表达、回收、提纯。
[0015] 一种重组合胞病毒蛋白中制备检测合胞病毒感染的试剂盒中的应用； 所述的试剂盒为胶体金试剂盒； 所述的胶体金试剂盒包括：一种重组合胞病毒蛋白划线包被浓度为1. 〇mg/mL，胶体金 结合物喷点量为60. 0yL/cm2,兔抗合胞病毒抗体包被量为1. 0yL/cm，包被浓度为5. 0 mg/mL。
[0016] 以下将更详细的描述本发明的技术方案： 本发明提供了一种编码合胞病毒蛋白的如SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列，利用该核 苷酸序列制备合胞病毒蛋白的方法，由该方法制备的包含SEQIDN0. 2所示氨基酸序列的 合胞病毒蛋白，以及包含该蛋白的组合物和试剂盒，同时还公开了它们在检测合胞病毒感 染的应用。
[0017]SEQIDNO. 1所示核苷酸序列可以通过本领域常规的方法制备，选择其强抗原表 位即合胞病毒RSV基因组（GenBank:U39661. 1)中DNA序列为模板，设计两对PCR引物（P1， P2)和（P3，P4)。pi和p2用于扩增合胞病毒基因组中第628位到第999位核苷酸，p3和p4 用于扩增第1140位到第2312位核苷酸；引物pi和p4分别带有BamHI和XhoI的酶切位 点，引物P2和p3顺序互补；利用P2中的连接引物将中间部分疏水片断去除，并根据大肠杆 菌的表达子偏爱性对基因序列进行了部分点突变。
[0018] 引物序列如下： P1 ：CGCGGATCCATGGACACACACAATGACACC P2 ：CTTGACTTTGCTAAGAGCCATTGGATTGAGATCATACTTGTATATTATGG P3：CCATAATATACAAGTATGATCTCAATCCAATGGCTCTTAGCAAAGTCAAG P4:CCGCTCGAGAAGCTCTACATCATTATCTTTTGG 以合胞病毒培养物为模板，以引物PI和P2扩增合胞病毒基因组中第628位到第999 位核苷酸片段，以引物P3和P4扩增第1140位到第2312位核苷酸片段；再以第一轮PCR扩 增得到的两片段为模板，加入引物P1和P4,扩增rRSV-58片段；得到串联的目的基因重组 片段rRSV-58。
[0019] 本发明对上述核苷酸序列的核酸分子采用适当载体和宿主细胞表达时可以大大 提高表达产率。
[0020] 本发明还提供应用如SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列制备合胞病毒蛋白的方法。 根据常规方法，可将含编码合胞病毒蛋白的如SEQIDNO. 1所示核苷酸序列的核酸分子连 接到一个表达载体中，然后通过常规方法转化细胞。通常，优选原核生物用于DNA序列的起 始克隆和用于本发明的载体构建。例如，大肠杆菌等肠科杆菌。
[0021] 编码本发明蛋白的核酸与pET_28a形成的杂合质粒具有高度的稳定性，有利于本 发明的蛋白的表达。
[0022] 在本发明的一个实施方案中，制备含有SEQIDNO. 1所示核苷酸序列的核酸分子 和pET-28a质粒的表达构建体，并将该构建体转化BL2KDE3)，经IPTG诱导培养后，收集菌 体。可采用常规的纯化方法纯化所得到的蛋白。
[0023] 本发明还提供用上述方法制备、纯化的合胞病毒蛋白，该蛋白具有SEQIDN0. 2所 示氨基酸序列。
[0024] 本发明还提供包含本发明合胞病毒蛋白的组合物和试剂盒。所述组合物或试剂盒 可制备成检测人合胞病毒感染的试剂或试剂盒形式，在临床上用于方便、快速和准确的检 测合胞病毒感染。任何生物学样品，只要它们含有合胞病毒抗体，就可用本发明蛋白，包含 该蛋白的组合物或试剂盒来检测。
[0025] 本文所述"试剂盒"是指利用本发明蛋白完成合胞病毒感染检测而组配制成的成 套试剂。该试剂盒用于诊断合胞病毒感染。在用于合胞病毒感染检测的试剂盒中，本发明 的合胞病毒蛋白也可以是经过标记的。具体可使用酶、金属螯合物等标记。优选的标记性 酶例如，辣根过氧化物酶，过氧化物酶，碱性磷酸酶等。优选的金属物质有胶体金等。
[0026] 目前市场上有加拿大HCB (Hermes Criterion Biotechnology)公司生产的"人抗 呼吸道合胞病毒抗体检测试剂盒（ELISA法)"是对合胞病毒抗体进行检测的。
[0027] 而采用本发明提供的重组合胞病毒蛋白制备的诊断试剂盒，与该试剂盒相比，具 有特异性强、灵敏度高、操作简便等优点，很好的满足了合胞病毒感染临床诊断的需要。
【附图说明】
[0028] 图1PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中M表示Marker，1表示扩增产物； 图2是诱导后菌体12% SDS - PAGE电泳图，其中M表示Marker，1表示目的蛋白。
【具体实施方式】
[0029] 以