一种编码l-丙氨酸氧化酶的基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种编码L-丙氨酸氧化酶的基因及其 应用。
【背景技术】
[0002] 丙氨酸是构成蛋白质的20种基本氨基酸之一，是血液中氮的优良运输工具，也是 一种有效的生糖氨基酸。D-丙氨酸主要由体内的L-丙氨酸消旋或从食物中直接摄取而 得。自然环境中的其它生物，如植物、昆虫、脊椎动物和无脊椎动物等，也检测发现D-丙氨 酸。对鸟类和哺乳动物而言，丙氨酸是非必需氨基酸，可由食物中的糖降解为丙酮酸后转化 而得。丙氨酸依照其分子结构的手性和旋光性，可分为L-丙氨酸（左旋物质）、D-丙氨酸 (右旋物质）和DL-丙氨酸（消旋物质）。D-丙氨酸在自然界中广泛存在。在人体组织和 体液中有游离的D-丙氨酸，人脑的灰质和白质中也有发现，在各类肽、蛋白质中还有大量 结合物。
[0003] 现已发现，D-丙氨酸有可预防肾结石、协助葡萄糖代谢，缓和低血糖等生理功能。 用作营养增补剂，可高效调节营养平衡。D-丙氨酸是一种重要的有机手性源，可用作手性 药物、手性添加剂、手性助剂等，广泛应用于制药及食品行业。D-丙氨酸作为一种有光学活 性的有机酸，在某些手性化合物不对称合成过程中的作用不可替代的，如用作生产新型广 谱抗生素、D-丙氨醇、多肽合成过程的丙氨酸保护剂。D-丙氨酸还具有一定的免疫抑制活 性，也可抑制某些植物的生长。
[0004]目前D-氨基酸的制备方法主要有化学合成法、对映体拆分法、以及生物合成法。 化学合成法主要是通过化学的方法直接合成D-丙氨酸，但是这个方法复杂，产物纯度低， 不利于大规模生产。对映体拆分法主要是通过各种方法如色谱柱，离子交换树脂等方法对 DL-丙氨酸直接进行拆分，但是该方法成本太高，产量低，不适合大规模生产。现有的生产 D-丙氨酸的一些方法，由于收率较低、拆分剂价格昂贵、成本偏高等原因，导致D-丙氨酸售 价过高，应用受限。
[0005] 无论采用何种方法制备D-丙氨酸，都有工艺流程长、步骤多、副产物去除过程复 杂，收率低，成本高且易污染环境等缺点，从而限制了D-丙氨酸的生产和市场推广。因此， 研究开发一种工艺路线短、生产成本低的D-丙氨酸生产方法变得十分迫切和必要。
【发明内容】
[0006] 为了克服上述技术的不足，本发明提供了一种L-丙氨酸氧化酶的基因克隆与表 达的方法，开发出一种生产工艺路线短、成本低的D-丙氨酸生产方法。
[0007] 本发明解决问题所采用的技术方案：
[0008] 本发明提供了一种编码L-丙氨酸氧化酶的基因，其是从已构建的酵母菌cDNA文 库中获得，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0009] 本发明获得的L-丙氨酸氧化酶是编码L-丙氨酸氧化酶基因表达产物，该酶由423 个氨基酸组成，其分子量为49523. 12Da，其氨基酸序列如SEQIDN0:2所示。
[0010] 本发明还提供了一种重组表达质粒，它由表达质粒和编码L-丙氨酸氧化酶的基 因重组而得。
[0011] 优选的是，所述的表达质粒为真核表达质粒pPICZaA。
[0012] 本发明还提供一种基因工程菌，其是由重组表达质粒转化宿主菌而得。
[0013] 本发明还提供了一种利用编码L-丙氨酸氧化酶基因制备L-丙氨酸氧化酶的方 法，包含以下步骤：
[0014] (1)克隆编码L-丙氨酸氧化酶的基因；
[0015] (2)将编码L-丙氨酸氧化酶基因与表达质粒连接构建重组表达质粒；
[0016] (3)将重组表达质粒线性化与纯化；
[0017] (4)将纯化后的重组表达质粒转化受体菌，筛选后获得基因工程菌；
[0018] (5)将基因工程菌诱导表达，纯化鉴定后获得L-丙氨酸氧化酶。
[0019] 优选的是，步骤（4)中所述的受体菌为毕赤酵母X-33。
[0020] 优选的是，步骤（5)中所述的基因工程菌利用甲醇进行诱导表达。
[0021] 优选的是，所述甲醇添加至终浓度0.6% (v/v)。
[0022] 本发明还提供了L-丙氨酸氧化酶在D-丙氨酸生产中的应用，其特征在于：所述 L-丙氨酸氧化酶能高效水解DL-丙氨酸中的L-丙氨酸，其酶解反应条件是：温度30°C，避 光条件下反应32h。
[0023] 与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：
[0024]1、本发明是从酵母菌的cDNA中直接获取的L-丙氨酸氧化酶基因。
[0025] 2、本发明涉及到该L-丙氨酸氧化酶基因克隆、与之相对应的氨基酸序列及其在 受体菌毕赤酵母X-33中的表达，该表达酶可以高效水解L-丙氨酸，为生物法合成D-丙氨 酸提供了一种新的方法。
[0026] 3、本发明的L-丙氨酸氧化酶能高效水解DL-丙氨酸的方法简单高效，实现不对称 降解法降解DL-丙氨酸生产D-丙氨酸，既提高其转化效率、缩短D-丙氨酸的工艺路线，又 减少环境污染。
【附图说明】
[0027] 图1为LA0基因、重组质粒Pmll和PCR鉴定图，是以重组克隆载体为模板进行PCR 扩增，回收产物和？？扣2&4分别经过？11111和乂6&1进行双酶切，其结果是通过0.8%琼脂糖 凝胶电泳检测；其中，在图1-1中M为DNAMaker;1为LA0基因PCR图；图1-2中M为DNA Mark;1为表达载体pPICZaA;2为重组载体。
[0028] 图2为重组子LA0在毕赤酵母X-33(P.pastorisX-33)中表达图，是用含空 pPICZaA载体的重组菌作为空白对照，经诱导表达后提取菌体蛋白，经12%SDS-PAGE分析； 其中M为DNAMark;第1孔为原始菌株表达LA0;第2-5孔为重组载体表达的LA0。
[0029]图3为酶促反应液高效液相色谱图，是将酶促反应液预处理后，用反相高效液相 色谱法检测反应结果，检测条件为：C18柱（5ym，250mmX4. 6mm)，流动相乙腈-异丙醇 (7 : 3)，柱温30°C，流速1. 0mL/min，UV检测波长280nm;其中保留时间为9. 315为L-丙氨 酸氧化酶氧化酶。
[0030] 图4为标品D-丙氨酸高效液相色谱图，标品D-丙氨酸反相高效色谱法检测结果， 检测条件为：astec手性柱（5iim，150mmX4. 6mm)，流动相：甲醇体积为分数为33%，磷酸氢 二钠浓度为〇. 〇lmol/L，PH= 6. 0,流速0. 05ml/min，柱温25°C，检测波长为200nn，进样量 5ul〇
【具体实施方式】
[0031] 下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不 局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此 夕卜，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同 样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
[0032] 实施例:
[0033] 1、文库来源和质粒
[0034] 酵母菌cDNA文库和pPICZaA均由本实验室保存。
[0035] 2、主要试剂
[0036]表达宿主菌P.pastorisX-33 (野生型）、抗生素Zeocin均购自invitrogen公司。 Pm11酶和Xbal酶均购自TaKaRa生物工程公司。
[0037] 3、方法
[0038] 3.1、基因的克隆与测序
[0039] 以自行设计的引物进行PCR扩增，采用25iiL的反应体系：10Xbuffer2. 5iiL， dTNP0?L，正反向引物各 0?L，cDNA模板 0?L，RTaq酶 0? 25iiL，补水至 25iiL。PCR 条件为：第一步：95°C5min，第二步：94°C50s，第三步：52°C45s，第四步：72°C2min，第五 步：72°ClOmin;其中第二步至第四步循环30次。PCR产物经0. 8%琼脂糖凝胶电泳