斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶 8 基因及其编码的蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明公开了斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因及其编码的蛋白，属于生 物基因技术领域。
【背景技术】
[0002] 细胞周期调控是一个精确调控的过程。在细胞分裂过程中真核生物的细胞周期可 以概括为两个大的阶段：细胞分裂间期（即G1时期、S时期和G2时期）和细胞分裂期（即 M时期），在细胞分裂时期，需要许多周期蛋白参与调控以保证其精确性。
[0003] ⑶K8是细胞核丝氨酸-苏氨酸激酶，功能是与cyclinC结合，作为DNA结合转录 因子和RNA聚合酶II的中介蛋白复合体的重要亚基，参与细胞的转录调节。CDK8与转录起 始相关的TFIIH(cyclinH/CDK7/Matl复合物）、Medl2、Medl3、RNAPII等相互作用共同调控 转录的起始。细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs)属于丝氨酸-苏氨酸激酶家族，CDKs的激酶 活性取决于结合的细胞周期蛋白（cyclin)和全酶的完整性，cyclin通过与CDKs特异性结 合位点的结合调控底物专一性的CDKs的激酶活性，CDKs主要参与调控细胞周期、转录和神 经元功能，哺乳动物中报道的⑶Ks约有20种，包括⑶K1-⑶K19。其中⑶K8作为转录起始 过程中重要的调控因子在人的研宄中最为广泛和深入，大多集中在肿瘤治疗和细胞信号通 路方面。1995年人们在寻找依赖cyclinC的激酶时确认了⑶K8,并通过实验证明⑶k8在 生物体内和体外都能够和cyclinC结合，CDK8作为细胞生长调控的中间信号，之后的实验 验证了⑶K8在转录调控中的重要作用。近年来⑶K8和cyclinC的异常表达经常在各类 人类肿瘤中发现，尤其在结肠和直肠癌中的研宄较多。CDK8作为中介蛋白复合体的关键组 分在转录等过程中的作用机理是当前研宄的热点。继人⑶k8(Homosapiens，NM_001260. 1) 被克隆出来以后，其它物种的⑶K8也得到了不同程度的研宄，如小鼠（Musmusculus， NM_153599. 3)、斑马鱼（Daniorerio，NM_194408.1)、果幡（Drosophilamelanogaster， U33015. 1)等，但在对虾中的研宄还较少。
[0004] 斑节对奸（Penaeusmonodon)是世界三大对奸养殖品种之一，人工育种过程中广 泛采用的剪除单侧眼柄的技术会导致亲虾的高死亡率和产卵质量低等问题。
【发明内容】
[0005] 针对上述问题，本发明的是以实验室高通量测序获得的EST序列为基础设计的 PCR扩增引物，并通过RACE技术克隆到斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因的全表达 序列；此外通过斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因设计荧光定量PCR引物，对细胞周 期蛋白依赖性激酶8在斑节对虾卵巢各个发育时相的分布情况及在不同组织中的分布情 况进行研宄分析。本发明构建了细胞周期蛋白依赖性激酶8原核表达重组质粒，通过原核 表达和亲和层析技术在体外成功获得重组蛋白。
[0006] 本发明提供的斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8基因，该基因序列如SEQID NO: 1所示。
[0007] 该基因的制备方法依次包括下述步骤：
[0008] 1、总RNA的提取
[0009] 取健康斑节对虾，解剖，取肌肉、卵巢、肝胰腺、脑、心脏、肠、精巢、胃等组织，并分 别将组织于lmLTrizol(Invitrogen，日本）中勾衆，按Trizol试剂盒使用手册提取斑节对 虾总RNA并用DEPC水悬浮，电泳观察所提取RNA的完整性，并置于-80°C保存。
[0010] 2、cDNA第一链的合成
[0011] 取上述斑节对虾总RNA2yL与反转录引物（5>GGCCACGCGACTAGTAC(T) 16〈3) 1y L(10pmol/L)混合在反转录酶（M-MLV，Promega，USA)的作用下合成cDNA-链，反应条件： 42°C60min,70〇C15min〇
[0012] 3、斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8的PCR扩增、克隆
[0013] 根据已获得EST序列设计基因特异性引物，利用cDNA末端快速扩增技术 和半巢式PCR技术扩增斑节对虾⑶K8基因的3'和5'未知序列。在3' RACE中， 一扩使用正向引物K8FSP1 (5>CTCCAGAGAGTAITCCTTTCACACG〈3)和接头通用引物 AP (5>GGCCACGCGACTAGTAC〈3);二扩使用正向引物K8FSP2 (5>GCAGGTCACAAAGGGAATGGTCA AG〈3)和接头通用引物AP (5>GGCCACGCGACTAGTAC〈3)。在5'RACE中，以K8RSP1 (5>TGCTGA CATAGACAATCCAGTGCCT〈3)和oligo-dG为引物进行一扩，用K8RSP2 (5>GGATGTITCAACTCTCGC AGCAATG〈3)和olig〇-dG(5>GGGGGGGGGGGGGGG〈3)进行二次PCR〇
[0014] 4、对斑节对奸细胞周期蛋白依赖性激酶8基因的测定
[0015] 所得到的PCR产物在1 %的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化 后，克隆到PMD-18T载体中，转化大肠杆菌（Escherichia coli)DH5a感受态细胞，挑取阳 性克隆进行测序。测序结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为斑节对虾细胞周期蛋 白依赖性激酶8基因同源序列。
[0016] 5、斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8的分布和表达
[0017] 提取健康的斑节对虾不同组织（包括卵巢、肝胰腺、脑、心、肠、血和淋巴）以 及不同发育时期的卵巢的总RNA，按照PremeScriptTM RT reagent Kit (TaKaRa)操作 手册进行反转录为cDNA模板。将不同组织样品cDNA稀释1倍作为模板，采用SYBR GreenI染料法，在Roche焚光定量PCR仪上进行扩增和数据分析。依照TaKaRaSYBR? PrimeScriptTMRTPCR Kit (Perfect Real Time)试剂盒说明书进行PCR反应。反应体系 为10yL，包含5yL的2X SYBR Green Real-time PCR Master Mix，3yL稀释的模板，各 0. 2yL正、反引物（10ymol/L)及1.6yL的双蒸水。每个时间点设置3个重复。反应参 数为95°C预变性10s;然后95°C变性15s，60°C退火延伸20s，共45个循环。使用引物reCD K8-F(5>TGACTITCGGACTGTITCGC〈3)和reCDK8-R(5>TTCCITTCCCCTTACGCTIT〈3)扩增目标基 因，RTEF-F(5>AAGCCAGGTATGGITGTCAACTTT〈3)和RTEF-R(5>CGTGGTGCATCTCCACAGACT〈3)扩 增EF-1 a基因作为内参，实验数据采用相对A CT法（2-A A CT法）分析斑节对虾细胞周 期蛋白依赖性激酶8基因在各样品中的相对表达量。
[0018] 6、斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶8的体外重组表达
[0019] 根据已经获得的胞周期蛋白依赖性激酶8开放阅读框（0RF)设计原核表达引物 (F :5>CATATGGATTATGAGTGGAAAGAG〈3 和