一种控制低温下水稻叶片颜色的基因ywl1及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程领域。具体地说，本发明涉及一种利用图位克隆技术克 隆水稻YWL1基因，利用转基因实验鉴定该基因的功能，及其该基因在杂交育种和良种繁育 中的应用。
【背景技术】
[0002] 叶片是植物进行光合作用的主要器官，水稻籽粒中2/3以上的干物质是开花后通 过光合作用获得的(王旭军，徐庆国，杨知建（2005)水稻叶片衰老生理的研究进展.中国农 学通报21:187-190)，光合作用的效率与叶绿体结构和功能是否完整、光合作用复合体的稳 定性、叶绿素含量的高低都有着复杂的关系。近年来，叶色的应用价值备受关注，叶色变异 可以作为标记性状，在水稻杂交育种和良种繁育发挥重要作用，不但可以用于苗期剔除受 外源花粉污染的种子和假杂种，还可以用于测定种子纯度(章志兴，陈善福（2001)叶色标记 技术在杂交水稻种子生产中的应用.种子科技19:33-34)。另外，叶色突变体的研究对有效 利用基因工程提高水稻的光合能力，培育高光效水稻，增加水稻产量具有重要的理论意义 和应用价值。
[0003]目前，利用水稻叶色突变体，已经克隆出多个参与或调控叶绿素代谢和叶绿体 发育的基因，通过分析基因功能、表达模式、基因间互作以及核-质信号传导，初步了解 了水稻叶色形成及调控机理。目前为止，在拟南芥叶绿素合成过程中的关键酶都已鉴定 出来（NagataN(2005)IdentificationofaVinyReductaseGeneforChlorophyll SynthesisinArabidopsisthalianaandImplicationsfortheEvolutionof ProchlorococcusSpecies.ThePlantCellOnline17:233-240)，但在水稻中只有少数 基因被鉴定出来，其他基因还有待进一步发现。此外，叶绿素降解的调控机制尚未明朗， 核-质互作的机理尚不清晰，有待深入进一步研究。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的问题是提供一种从水稻温度敏感突变体中克隆新基因YWL1，该 基因编码假尿嘧啶核苷合酶家族蛋白，调控低温下水稻叶片颜色的正常形成。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种调控叶绿体正常发育的基因YWL1，该基 因基因显性等位基因序列如SEQIDNO. 1所示，其⑶S序列如SEQIDN0. 2所示，其编码 的的蛋白质为一个假尿嘧啶核苷合酶蛋白，其氨基酸序列如SEQIDN0. 3所示。
[0006] 所述YWL1突变体含有其突变基因，其基因序列如SEQIDNO. 4所示，其⑶S序列 如SEQIDN0. 5所示，编码氨基酸序列如SEQIDN0. 6所示。
[0007] 作为本发明的基因的改进：核苷酸序列还包括在SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列 中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。
[0008] 所述基因YWL1突变后，突变体在低温下水稻叶片颜色显示为白条纹状，高温或正 常温度条件下为正常绿色，该突变体白条纹表型可以作为表型标记用于杂交育种和良种繁 育，不但可以测定种子纯度，还可在苗期剔除假杂种。
[0009] 本发明的具体实施步骤如下： 一、水稻白条纹叶突变体为温度敏感型突变体 在水稻品种93-11的EMS诱变的突变体库中，发现了一个苗期表现出白条纹叶的叶色 突变体_fW7。温度处理发现该突变体叶色白条纹状对温度敏感，在23°C条件下，突变体苗 期出现严重的白条纹叶，而在28°C环境下突变体与野生型叶色没有明显差异，在25°C环境 下，相对野生型93-11突变体表现出轻微的白条纹叶性状（图1)。
[0010] 二、不同温度环境下突变体ywll叶片叶绿素含量、叶绿体发育和光合特性分析 为了明确叶色动态变化过程，我们分别测量了植株一叶期至五叶期叶片叶绿素 含量（图2)。从测量结果可以看出，该突变体叶绿素含量随着植株的生长而逐渐增加。23°C条件下，野生型中叶绿素a、叶绿素b及叶绿素总量始终高于突变体；25°C条件下三叶期以 前，野生型叶绿素a、叶绿素b及叶绿素总量高于突变体，三叶期以后二者叶绿素含量趋于 一致；28°C条件下，二者叶绿素a、叶绿素b及叶绿素总量基本一致，与表型结果一致。
[0011]利用扫描电镜对23 °C温度环境条件下，突变体和野生型93-11苗期植株第三 片叶叶肉细胞中叶绿体观察表明，突变体叶片的白色部分中大部分细胞内部结构简单，仅 有少量的片状结构，而且尚未分化出类囊体片层结构及基粒；个别细胞能观察到叶绿体，与 野生型相比，突变体的叶绿体数目少，体积小，类囊体片层间距离变大，排列疏松，整个叶绿 体表现发育不良；而突变体叶片绿色部分中叶绿体数目、体积及基粒片层垛叠数与野生型 没有明显差异（图3)。
[0012]对光合作用相关指标分析发现，23°C环境下的突变体在苗期净光合速率 (Pn)、气孔导度（Gs)和蒸腾速率（Tr)比野生型显著下降，表现出较严重的光合能力下降特 征，抽穗期恢复与野生型一致；25°C环境下的突变体，苗期除净光合速率（Pn)比野生 型显著下降外，气孔导度（Gs)和蒸腾速率（Tr)与野生型没有显著差异，抽穗期时三项指标 均与野生型一致；28°C环境下的突变体无论苗期或是抽穗期，净光合速率（Pn)、气孔 导度（Gs)和蒸腾速率（Tr)均与野生型一致（图4)。
[0013] 三、图位克隆1TZ7基因 1. 突变体表型的遗传分析 本研究对突变体表型进行了相应的遗传分析。突变体与野生型93-11杂交， 以及突变体与粳稻02428杂交得到的F1植株均表现为正常表型。突变体与粳 稻02428杂交得到的F2群体中，正常表型与白条纹状表型单株出现分离，正常表型和突变 表型单株的分离比符合分离比3:1 (见表1)。因此遗传分析结果表明突变体的表型 符合单隐性核基因的遗传分离规律。
[0014] 表1F2群体中白条纹叶植株和正常叶色植株的分离情况
【主权项】
1. 一种控制低温下水稻叶片颜色的基因1TZ7,其特征在于该基因显性等位基因序列 如SEQ ID NO. 1所示，其CDS序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. -种如权利要求1所述的控制低温下水稻叶片颜色的基因1TZ7编码的假尿嘧啶核 苷合酶蛋白，其特征在于该假尿嘧啶核苷合酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
3. -种如权利要求1所述的控制低温下水稻叶片颜色的基因1TZ7的突变体基因，其特 征在于该突变体基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，其⑶S序列如SEQ ID NO. 5所示。
4. 如权利要求3所述的突变体基因编码的蛋白质，其特征在于该突变体基因编码蛋白 质的氨基酸序列如SEQ ID No. 6所示。
5. -种控制低温下水稻叶片颜色的基因1TZ7在培育叶绿体发育状况变化的转基因植 物中的应用。
6. 含有如权利要求3所述的7FZ7的突变体基因的水稻材料表现出来的低温白条纹叶 性状作为标记性状在杂交育种和良种繁育中的应用。
【专利摘要】本发明属于基因工程技术领域，涉及一种控制低温下水稻叶片颜色的基因YWL1及其应用。该基因编码一个假尿嘧啶核苷合酶蛋白，该基因显性等位基因序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列,在低温下使水稻叶片维持正常绿色。该基因的突变体基因的DNA序列如SEQ ID NO.4所示，该突变体基因使得低温下水稻叶片颜色显示为白条纹状。本发明所述的YWL1基因突变体表现出来的低温白条纹叶性状可以作为标记性状用于杂交育种和良种繁育，不但可以测定种子纯度，还可在苗期剔除假杂种。
【IPC分类】C12N15-60, C12N9-88, A01H5-00
【公开号】CN104593395
【申请号】CN201410823573
【发明人】魏祥进, 胡培松, 唐绍清, 刘聪利, 邵高能, 圣忠华, 焦桂爱, 谢黎虹
【申请人】中国水稻研究所
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2014年12月26日