为：第一步：95°C5min，第二步：94°C50s， 第三步：52°C45s，第四步：72°C2min，第五步：72°ClOmin;其中第二步至第四步循环30次。 PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的基因后与pGM-Tvector连接，得到重组质 T4DNA连接酶1yL，双蒸水2yL，16°C连接12h过夜。用10yL连接液转化100yL感受态E.coliDH5a，将装有感受态细胞的EP管在冰浴中静止30min，接着移至42°C水浴中热激 90S，随后快速将EP管转移至冰浴2min，最后加900yLLB培养基混匀后37°C摇床震荡培 养 45min(150r/min)。取 100yL感受态细胞涂布在含Amp(100yg/mL)、IPTG(0? 5mmol/L)、 X-gal(0.004% )的LB(0.5%酵母膏、1%胰蛋白胨、1%氯化钠）平板上37°C培养16小时 后挑取白色菌落，接种于含Amp的LB培养基中，抽提质粒进行PCR和酶切验证、测序。
[0042] 3. 2、pPICZaA表达载体的构建
[0043] 以重组克隆载体为模板进行PCR扩增，回收产物。将回收产物和pPICZaA分别进 行Pmll和Xbal双酶切，双酶切体系如下：Pmll和XbaI各1. 5yL，NEBBuffer2. 13. 0yL， 0.1%BSA3.0yL，pPICZaB18.0yL，ddH20 3.0yL，总体积 30.0yL。37°C反应 12h，回收 目的基因、与目的基因有相同粘性末端的PPICZaA片段，将两者连接，连接反应体系如下： 10XT4DNALigaseBuffer2.0yL，maf片段 8.0yL，pPICZaB酶切片段 2.0yL，T4 连接酶 2. 0yL,ddH206. 0yL,Tota120. 0yL, 16°C反应 12h，并转化E.coliDH5a，Amp抗性筛选， 抽提重组质粒进行PCR，酶切鉴定，将鉴定后的重组质粒pPICZaA-maf?测序，进一步验证。双 酶切及PCR结果见图1。
[0044] 3. 3、质粒pPICZaA-maf的线性化与纯化
[0045] 线性化：选择SacI作为酶切位点，反应体系如下：SacI10yL，10XL Bufferl5yL，pPICZaA-maf110yL，ddH20 15yL，总体积 150yL。16°C反应 3h。按照常 规的苯酚抽提、乙醇沉淀洗涤进行质粒纯化，以无菌水溶解沉淀。加等体积的得酚/氯仿， 混勾后lOOOOrpm离心lOmin，小心取上清液至一干净EP管，加入两倍体积的冰冻无水乙醇， 混匀后冰箱_20°C放置30min，lOOOOrpm离心10min，弃上清，沉淀用75%乙醇清洗一次。
[0046] 3. 4、毕赤酵母X-33电转化和重组酵母筛选
[0047] 吸取10yL已纯化化的表达质粒与80yLX-33感受态细胞混合，在1500V下电转 5ms，然后取150yL菌液均匀涂布于含100yg/mLZeocin的YPD平板。挑取具有Zeocin 抗性的菌落进行MD/MM快慢斑筛选。表达质粒在毕赤酵母X-33中表达结果见图2。
[0048] 3. 5、阳性转化子诱导培养
[0049] 挑取阳性转化子接种于25mLBMGY，于30°C，200r/min摇床震荡培养至0D600为3 时，收集菌体，用BMMY重悬细胞至0D600至1.0,每24h补加100%甲醇至终浓度为0.5%， 诱导培养。
[0050] 3. 6、重组酵母菌粗酶液提取
[0051] 重组酵母菌X33-pPICZaA-maf经甲醇诱导，离心除去菌体，取20yL上清液超滤 浓缩得到10yL酶液。
[0052] 3. 7、以胆固醇为底物进行转化
[0053] 将lgL-丙氨酸溶解于含10mL1%Tween80、0. 01mol/LpH7. 4的磷酸缓冲溶液 中，加入10ml酶液混合，37°C反应12h。反应液用石油醚萃取，石油醚与反应液体积比为5 : 1，萃取温度40°C，萃取时间60min。收集反应液采用反相高效液相色谱法检测反应结果，检 测条件为：手性柱（5ym，150mmX4. 6mm)，流动相流动相甲醇体积为分数为33%，磷酸氢二 钠浓度为〇. 〇lmol/L，PH= 6. 0,柱温30°C，流速1.0mL/min，进样量为20yL，UV检测波长 254nm。检测结果显示，反应液含有D-丙氨酸，其出峰时间与标品D-丙氨酸一致，结果参见 附图3和附图4。
[0054] 前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述 并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变 和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应 用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及 各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
[0055]
[0056]
[0057]
[0058]
【主权项】
1. 一种编码丙氨酸异构酶的基因，其是从已构建的酵母cDNA文库中获得，其特征在 于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2. -种丙氨酸异构酶，其特征在于：所述丙氨酸异构酶为编码丙氨酸异构酶基因表达 产物，由399个氨基酸组成，其分子量为46880. 57773Da，所述丙氨酸异构酶的氨基酸序列 如 SEQ ID NO:2 所示。
3. -种重组表达质粒，其特征在于：它由表达质粒和权利要求1所述基因经重组而得。
4. 根据权利要求3所述重组表达质粒，其特征在于：所述表达质粒为真核表达质粒 pPICZaA〇
5. -种由权利要求3或4所述重组表达质粒转化宿主菌而得的基因工程菌。
6. -种利用权利要求1所述编码丙氨酸异构酶基因制备丙氨酸异构酶的方法，其特征 在于：包含以下步骤： (1) 克隆编码丙氨酸异构酶的基因； (2) 将编码丙氨酸异构酶基因与表达质粒连接构建重组表达质粒； (3) 将重组表达质粒线性化与纯化； (4) 将纯化后的重组表达质粒转化受体菌，筛选后获得基因工程菌； (5) 将基因工程菌诱导表达，纯化鉴定后获得丙氨酸异构酶。
7. 根据权利要求6所述制备丙氨酸异构酶的方法，其特征在于：步骤（4)中所述受体 菌为毕赤酵母X-33。
8. 根据权利要求6所述制备丙氨酸异构酶的方法，其特征在于：步骤（5)中所述基因 工程菌利用甲醇进行诱导表达。
9. 根据权利要求8所述制备丙氨酸异构酶的方法，其特征在于：所述甲醇添加至终浓 度为 0. 5% (v/v)。
10. 根据权利要求2所述丙氨酸异构酶在D-丙氨酸生产中的应用，其特征在于：所述 丙氨酸异构酶能转化L-丙氨酸为D-丙氨酸，其酶解反应条件是在温度37°C，反应12h。
【专利摘要】本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种编码丙氨酸异构酶基因的克隆与表达。本发明提供一种编码丙氨酸异构酶的基因，其是从已构建的酵母cDNA文库中获得，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。该编码丙氨酸异构酶基因经过克隆后与表达质粒连接构建重组表达质粒，重组表达质粒线性化与纯化后转化受体菌，筛选获得基因工程菌，经过诱导表达、纯化鉴定后获得丙氨酸异构酶。本发明采用丙氨酸异构酶可实现一步酶法将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸，既提高其转化效率、缩短D-丙氨酸的工艺路线、降低生产成本又减少环境污染。
【IPC分类】C12N15-81, C12N9-90, C12R1-84, C12N15-61, C12N1-19
【公开号】CN104593396
【申请号】CN201510025232
【发明人】黄时海, 李湘萍, 盘慧群, 黄广上, 鄢凯舟, 梁智群, 陈桂光, 苏辉兰, 王国盼, 李丽, 刘诗宇, 李连威, 付跃
【申请人】广西大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月19日