一种1型鸭甲肝病毒DNA-Launched感染性克隆的构建方法

文档序号:8277631阅读:610来源:国知局
一种1型鸭甲肝病毒DNA-Launched感染性克隆的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明所涉及的是一种1型鸭甲肝病毒DNA-Launched感染性克隆的构建方法,属 于病毒分子生物学领域。 (二)
【背景技术】
[0002] 1型鸭甲肝病毒是一种感染1-3周龄雏鸭为主的高传染性、高死亡率的单股正 链RNA病毒,属于小RNA病毒科(Picornaviridae)禽肝病毒属(Avihepatovirus)。该 病毒全长7700bp,包含5'非编码区(untranslatedregion,UTR)、一个大的开放阅读框 (open-readingframe, 0RF)和 3'UTR(3'untranslatedregions)和poly(A)尾。5'UTR 没有帽子结构,但有内部核糖体进入位点(theinternalribosomeentersite,IRES)。
[0003] 目前,反向遗传学技术是深入开展鸭甲肝病毒的致病机理及蛋白功能的研宄等 方面研宄的最有力手段。RNA病毒反向遗传系统是指以RNA病毒的基因组的cDNA为模 板,分段定向克隆到载体上,体内或体外转录后重新拯救出活病毒或类似病毒物质,也成为 RNA-Launched感染性克隆。对于单股正链的DHAV-I而言,研宄的核心是构建病毒的感染 性cDNA分子克隆,即在获得病毒基因组全序列的基础上,借助于某些载体,将病毒的全长 cDNA分子克隆入载体中,同时将RNA合酶的启动子元件序列也无缝插入分子克隆中,通过 体外转录方法得到病毒mRNA,然后转染敏感细胞系,拯救出与母本病毒具有相似生物特性 的活病毒。该方法具有以下弊端:1.为了确保病毒的开放阅读框被准确转录、翻译,RNA聚 合酶必须无缝添加到DHAV-1序列前,即RNA聚合酶与病毒cDNA序列间不能有多余碱基, 这样就使得长片段RNA聚合酶的添加异常困难。2.需要进行体外转录:鸭甲肝病毒I型 RNA-Launched感染性克隆构建完成后,首先需要利用添加在病毒序列尾端的限制性内切酶 将重组阳性质粒线性化,继而将线性化的重组质粒进行体外转录,最后将体外转录产物转 染易感细胞。体外转录具有操作难度大、无法保证转录出的mRNA完整性等缺点。3.转染效 率低:体外转录的产物为单股、线性化的mRNA,转染效率较质粒低。4.经济负担大:目前国 内外出售的体外转录试剂盒价格昂贵,增加试验经费。 (三)

【发明内容】

[0004] 为了解决上述问题,本发明提供了一种1型鸭甲肝病毒DNA-Launched感染性克隆 的构建方法,是一种操作简便、高效、节约的感染性克隆构建方法。
[0005] 本发明在构建过程中,通过PCR方法在1型鸭甲肝病毒核酸序列的5'端和3' 端分别添加了具有自我剪切性质的核酶序列hammerheadribozyme(ACATCATCTGAT GAGTCCGTGAGGACGAAACGGTACCCGGTACCGTCAT)和h印atitisdeltavirus ribozyme(GTCCCATTCGCCATTACCGAGGGGACGGTCCCCTCGGAATGTTGCCCAGCC GGCGCCAGCGAGGAGGCTGGGACCATGCCGGCC)。该重组质粒可以直接转染细胞,转录 出两端带有核酶序列的mRNA。上述核酶序列在Mg2+存在的条件下,可以实现自我剪切,故 可得到病毒mRNA。
[0006] -种用于构建 1 型鸭甲肝病毒(DuckhepatitisAvirustype1,DHAV-1) DNA-Launched感染性克隆的方法,包括以下步骤:
[0007] A、根据DHAV-1 的LY0801 株(GenBank登录号为FJ436047.l)RNA-launched感染 性克隆和载体pIRES2-EGFP(Clontech公司)的序列,设计引物进行PCR反应。
[0008] 5HeadRib〇-F:5'-ACATGGCGCGCCACATCATCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAA CGGTACCCGCGTGAGGACGAAACGGTACCCGGTACCGTCATTTTGAMGCGGGTGCATGC ATGGCCAT-3'
[0009] 5HeadRib〇-R:5'-AGGTGGATCCACTATTGTCACCTTC_3'
[0010] 3endRib〇-F:5'-TAGTGGATCCACCTGAAACACC_3'
[0011] 3endRib〇-R:5'-GCTCTAGAGTCCCATTCGCCATTACCGAGGGGACGGTCCCCT CGGMTGTTGCCCAGCCGGCGCCAGCGAGGAGGCTGGGACCATGCCGGCCTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTAGGTAGGGTAGGGAATAGTAAAGT-3'
[0012] pIR-XhoI-F:5,-GTCTAGACATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGG-3'
[0013] pIR-AscI-R:5'-GAAGGCGCGCCTCGAGATCTGAGTCCGGTAG_3'
[0014] BamHI-detect-F:ACAACTGGTGGTGCCATTTGTGT
[0015] BamHI-detect-R:TTGACTGCATGTGATCACCTGCTGG
[0016] 引物设计过程中,将DHAV-1病毒基因组序列AGGTGAATCCACTATTGTCACCTT C(斜体A为3'到5'顺序、位于病毒基因组3042位碱基需要突变的碱基)突变为AGGT匹 ATCCACTATTGTCACCTTC(斜体G为突变后的碱基)并作为添加5'核酶的下游引物 (5HeadRib〇-R),将序列TAGTGGATTCACCTGAAACACC(斜体T为 5' 到 3' 顺序、位于病 毒基因组3042位碱基需要突变的碱基需要突变的碱基)突变为TAGTGGATCCACCTGAAA CACC(斜体C为突变后的碱基)并作为添加3'核酶的上游引物(3endRib〇-F)。为了将 hammerheadribozyme引入5'上游,同时将突变(碱基A突变为碱基G)引入病毒基因组, 以 5HeadRib〇-F、5HeadRib〇-R为上下游引物,以DHAV-1 的LY0801 株RNA-launched感染性 克隆为模板进行扩增,得到片段A。为了将hepatitisdeltavirusribozyme引入3'下 游,同时将突变(碱基T突变为碱基C)引入病毒基因组,以3endRib〇-F、3endRib〇-R为上 下游引物,以DHAV-1的LY0801株RNA-launched感染性克隆为模板进行扩增,得到片段B。 片段A和B扩增体系为:15.3ylddH20(Rnasefree),2.5yl10XEX-TaqBuffer,2yl dNTPs(10.OmM),2y1MgCl2 (25mM),上下游引物(片段A为 5HeadRib〇-F、5HeadRib〇-R,片 段B为 3endRib〇-F、3endRib〇-R)各 1y1,DHAV-1 的LY0801 株RNA-launched感染性克隆 阳性质粒lul,〇. 2ylEX-Taq酶。片段A和B的扩增条件均为:95°C10min,95°C50s, 55°C50s,72°C4min,72°C10min。由于扩增片段A时,将突变(碱基A突变为碱基G)引入 病毒基因组,扩增片段B时将突变(碱基T突变为碱基C)引入病毒基因组,二者互补配 对,以片段A、B为模板进行PCR即可达到突变DHAV-1第3042位碱基的目的。因此以片段 A和片段B为模板,以5HeadRib〇-F和3endRib〇-R为上下游引物,扩增得到片段C。扩增 体系为:15.3ylddH20(Rnasefree),2.5yl10XEX-TaqBuffer,2yldNTPs(lO.OmM), 2ylMgCl2(25mM),5HeadRib〇-F和3endRib〇-R各lyl,片段A和片段B的胶回收产物各 lyl,0.2ylEX-Taq酶。片段C的扩增条件为:95°C10min,95°C50s,55°C50s,72°C7min, 72°C10min〇
[0017] B、以pIR-XhoI-F和pIR-AscI-R为上下游引物,以载体pIRES2-EGFP(Clontech公 司)为模板进行PCR扩增。扩增体系为:15. 3y1ddH20(Rnasefree),2. 5y1 10XEX-Taq Buffer,2yldNTPs(10.0mM),2ylMgCl2(25mM),pIR-XhoI-F和pIR-AscI-R各lyl, 0.2ylEX-Taq酶。扩增条件为:95°G10min,95°G50s,55°G50s,72°G5min,72°GlOmin。 将扩增产物命名为pIR。
[0018] C、分别酶切片段C和片段pIR,反应体系为:片段C/片段pIR40y1, 10XCutSmart-Buffer5yl,XhoI与AscI(NEB公司)各 2. 5y1。反应条件为 37°C水浴 2h。 分别用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(康为世纪公司)回收酶切产物,进行连接,连接的 体系为:片段C胶回收产物7yl,片段pIR胶回收产物lyl,10XT4Bufferlyl,T4连接 酶1U1,反应条件为4°C水浴过夜,转化DH5a感受态并挑取阳性克隆,得到重组质粒即为 DNA-Launched感染性克隆阳性质粒,并将其命名为pIR-DHAV-1。 (四)
【附图说明】
[0019] 图1 1型鸭甲肝病毒DNA-Launched感染性克隆构建方法示意图
[0020] 图2基因标记检测
[0021] 图中:M:Maker2000 ;1,母本病毒PCR扩增结果图;2,BamHI消化母本病毒PCR产 物电泳图;3,BamHI消化拯救病毒PCR产物电泳图;4,PCR扩增拯救病毒电泳图。
[0022] 由于突变插入DNA-Launched感染性克隆的BamHI位点位于BamHI-detect-F和 BamHI-detect-R扩增的序列范围内,因此,只有通过感染性克隆拯救的病毒粒子才在BamH I-detect-F和BamHI-detect-R扩增范围内具有此BamHI位点,野生病毒不存在此位点。 因此只有通过DNA-Launched感染性克隆拯救出的病毒才能被BamHI位点切割成为1785bp 和504bp的条带,野生病毒不能被BamHI位点切割。
[0023] 图3间接免疫荧光检测
[0024] 图中:IFA结果:A.阴性对照组B.转染组(转染DNA-Launched感染性克隆重组质 粒组)C.阳性对照组(野生病毒感染组)
[0025] IFA反应中使用的一抗为特异性的DHAV-1的单克隆抗体进行,二抗为FITC标 记羊抗鼠的二抗。图中转染组和阳性对照组均出现了特异性的绿色荧光,表明通过转染 DNA-Launched感染性克隆重组质粒可以得到DHAV-1病毒粒子。 (五)
【具体实施方式】
[0026] 1融合PCR反应
[0027] A、根据DHAV-1的LY0801株RNA-launched感染性克隆和载体 PIRES2-EGFP(Clontech公司)的序列,设计引物进行PCR〇
[0028] 5HeadRib〇-F:5'-ACATGGCGCGCCACATCATCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAA CGGTACCCGCGTGAGGACGAAACGGTACCCGGTACCGTCATTTTGAMGCGGGTGCATGC ATGGCCAT-3'
[0029] 5HeadRib〇-R:5'-AGGTGGATCCACTATTGTCACCTTC_3'
[0030] 3endRib〇-F:5'-TAGTGGATCCACCTGAAACACC_3'
[0031] 3endRib〇-R:5'-GCTCTAGAGTCCCATTCGCCATTACCGAGGGGACGGTCCCCT CGGMTGTTGCCCAGCCGGCGCCAGCGAGGAGGCTGGGACCATGCCGGCCTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTAGGTAGGGTAGGGAATAGTAAAGT-3'
[0032] pIR-XhoI-F:5,~GTCTAGACATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGG-3'
[0033] pIR-AscI-R:5'-GAAGGCGCGCCTCGAGATCTGAGTCCGGTAG_3'
[0034] BamHI-detect-F:ACAACTGGTGGTGCCATTTGTGT
[0035] BamHI-detect-R:TTGACTGCATGTGATCACCTGCTGG
[0036] 引物设计过程中,将DHAV-1病毒基因组序列AGGTGAATCCACTATTGTCACCTT C(斜体A为3'到5'顺序、位于病毒基因组3042位碱基需要突变的碱基)突变为AGGT匹 ATCCACTATTGTCACCTTC(斜体G为突变后的碱基)并作为添加5'核酶的下游引物 (5HeadRib〇-R),将序列TAGTGGATTCACCTGAAACACC(斜体T为 5' 到 3' 顺序、位于病 毒基因组3042位碱基需要突变的碱基需要突变的碱基)突变为TAGTGGATCCACCTGAAA CACC(
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