一种抗肿瘤化合物筛选模型的建立方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种以体轴向背侧弯曲为标识的高通量逆转斑马鱼Sonic Hedgehog(Shh)信号通路过表达抗肿瘤化合物筛选模型的建立方法及其应用，即以Shh信号通路为靶点的药物高通量筛选模型的建立方法，在药物筛选过程中通过直接观察斑马鱼体轴向背侧弯曲的表型即可确定药物是否可以逆转Shh信号通路过表达，从而达到药物筛选的应用目的。
【背景技术】
[0002]斑马鱼基因与人类相似度高达87%，并且以其体型小和繁殖便利等优势成为良好的模式生物。
[0003]在以往的高通量药物筛选实践中，药物筛选主要是在细胞水平进行的，而细胞水平和活体水平各种条件的有着极大的差异，因此细胞水平进行的药物筛选往往在活体水平得不到一致效果。
[0004]在多种肿瘤细胞中Shh信号通路异常活化，已知Shh通路的活化在如基底细胞瘤，黑色素瘤，前列腺癌，脑肿瘤等肿瘤发生中起到了关键的作用。因此开发抑制Shh信号通路的靶向药物成为抗癌药物研发的一个热门方向，目前国际上多种Shh信号通路的靶向药物已经从研宄步入临床阶段，比如Glil/2的抑制剂GANT61，SMO的抑制剂⑶C-0449和LY2940680，这些药物都是通过抑制Shh通路信号通路以达到抑制肿瘤的目的。
[0005]TULP3基因是一种Shh信号通路的抑制因子，它发挥作用是通过与一种GPCR蛋白Gprl61结合激活cAMP-PKA信号通路，Gli3成为抑制型进而抑制Shh下游基因的表达。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种简单直观反映斑马鱼Shh信号通路过表达表型的模型建立方法及模型在抗肿瘤药物筛选方面的应用。
[0007]本发明的基本技术原理如下，利用斑马鱼TULP3基因特异性的Morpholino寡聚核苷酸使斑马鱼胚胎中正常tulp3蛋白表达水平降低并致使Shh下游基因表达量显著升高，从而达到使Shh信号通路过表达的效果，其直观表型为斑马鱼体轴向背侧弯曲；而在利用该模型筛选药物时，如果某药物能够逆转上述直观表型时，即说明某药物是有抑制Shh通路的作用的。
[0008]本发明中针对斑马鱼TULP3基因设计的特异性Morpholino寡聚核苷酸序列作用于TULP3基因的第四个外显子和第四个内含子交界处，具体序列为5’-TGCAGTATGTTTGTACCGTCGAGTA-3’。在用其进行显微注射斑马鱼胚胎30小时后可以观察到Shh通路表达异常的标志性体节“U-shaped”表型以及体轴向背侧弯曲的宏观表型。在适当浓度的Morpholino注射时体轴向背侧弯曲的特异性表型接近全部注射胚胎的百分之五十，具有良好的对比尺度。
[0009]通过对58小时的Morpholino处理组胚胎和正常组胚胎进行qRT-PCR检测Shh信号通路下游关键基因，可见Shh信号通路中Gli I，Ptchl，Ptch2表达水平都明显上调。此外通过对58小时时相的TULP3基因的cDNA进行测序可以发现在第四个外显子和第四个内含子处有18bp的杂合缺失，验证了 Morpholino寡聚核苷酸序列对TULP3基因本身转录水平产生了效应。这意味着以体轴向背侧弯曲为标识的Shh信号通路过表达的药物筛选斑马鱼模型已建立成功。
[0010]本发明所述模型适用于以Shh通路为靶标的药物筛选，在实际操作过程中，一方面可以统计体轴向背侧弯曲的表型出现率，另外一方面可以观察体轴向背侧弯曲的程度。如果某种药物能使得体轴向背侧弯曲的表型发生率下降并且缓解弯曲程度，证明了该药物可以对Shh信号通路起到抑制作用。反之，如果某种药物能够使得体轴向背侧弯曲的表型发生率上升并且加重弯曲程度，证明该药物可以对Shh信号通路起激活作用。
[0011 ] 本发明一种以体轴向背侧弯曲为标识的高通量逆转斑马鱼SonicHedgehog (Shh)信号通路过表达抗肿瘤化合物筛选模型的建立方法，其步骤包括:
[0012](I)Morpholino吗啡琳寡聚核苷酸的合成:Morpholino吗啡琳寡聚核苷酸特异序列具体为 5’ -TGCAGTATGTTTGTACCGTCGAGTA-3’。
[0013](2)斑马鱼品系选择:选择野生型AB品系作为实验用鱼。
[0014](3)斑马鱼胚胎收集，具体步骤:
[0015]3.1)斑马鱼胚胎的繁殖以自然成对交配的方式进行，每次交配准备6?10对成年斑马鱼，平均每对能产200?300个胚胎。
[0016]3.2)收取受精后0.75小时内的斑马鱼胚胎。
[0017]3.3)在28.5±0.5°C条件下，用养鱼用水孵育胚胎，其中养鱼用水水质:每IL反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为480?510 μ S/cm ；pH为9?2 ;硬度为53.7?71.6mg/L CaC03。
[0018](4)Morpholino寡聚核苷酸的显微注射:
[0019]4.1)注射前一天，选取30条优质成年斑马鱼进行人工交配，雌雄比例为1:2。
[0020]4.2)挑出死卵和未受精卵，收集高质量的单细胞受精卵。
[0021]4.3)制作显微注射针，利用拉针仪进行拉制，并在体式显微镜下进行针头切割，以获得针头孔径大小合适的成品注射针。
[0022]4.4)配置不同浓度的显微注射液。
[0023]4.5)制作显微注射盘。
[0024]4.6) Morpholino寡聚核苷酸的显微注射:选取单细胞期的斑马鱼胚胎进行Morpho I ino的显微注射，每组注射200枚斑马鱼胚胎，每枚胚胎注射剂量为8ng的Morpholino寡聚核苷酸。
[0025](5)胚胎饲养及护理:
[0026]5.1)在注射后的各实验组斑马鱼胚胎中加入新鲜的胚胎培养液，并放入28.5±0.5 °Cf旦温培养箱中进行培养。
[0027]5.2)及时挑出培养液中的死胚胎，并定时人工更换斑马鱼胚胎培养液，更换培养液的发育时相点为1.5hpf、6hpf、24hpf。
[0028](6)表型初步观察:
[0029]6.1)在体式显微镜下选取10hpf、24hpf、30hpf的发育时相点进行观察。
[0030]6.2)出现体轴向背侧弯曲的特异表型时，开始在体式显微镜明视场中统计特异表型。
[0031](7)图像获取及统计:
[0032]7.1)利用针头镊子进行斑马鱼胚胎早期人工破膜。
[0033]7.2)将破膜之后的胚胎进行麻醉，然后置于甲基纤维素中，在体式荧光显微镜下进行拍照。
[0034]7.3)随机取20尾斑马鱼在体式显微镜下进行拍照并保存图片。
[0035]7.4)对表型进行统计，观察体轴向背侧弯曲的特异表型的出现比例及体轴弯曲程度。
[0036]另外，本发明还提出了一种以体轴向背侧弯曲为标识的高通量逆转斑马鱼SonicHedgehog(Shh)信号通路过表达抗肿瘤化合物筛选模型的应用。
[0037]应用加入药物筛选组的具体方法为:
[0038]I)按上述方法建立化合物筛选模型。
[0039]2)选择合适的小分子化合物库。本实施例中，小分子化合物来自于美国范德比特大学(Vanderbilt University)化学生物所的高通量药物筛选库中获取的化合物库，每种化合物用DMSO稀释配成ImM的储存液。
[0040]3)每种化合物以5um、10um、20um终浓度梯度用胚胎培养液进行稀释，同时应稀释相应浓度的DMSO作为空白对照，共六个胚胎培养液体系。
[0041]4)化合物处理过程，以上述六个体系胚胎培养液为一个单位建立完整的药物组，现将10ul各药物组的六种胚胎培养液加入96孔板相应位置，之后将10枚Morpholino寡聚核苷酸的显微注射5小时后的胚胎放入96孔板中，一块96孔板可以筛选多达16组药物。
[0042]5)表型初步观察、图像获取及统计按照上述方法进行。
[0043]6)以体轴向背侧弯曲的表型为统计标准，通常情况下每孔中的斑马鱼会有4?6条呈现该表型，如果某个孔中该表型出现率显著下降或上升，则需要对该孔对应药物通过扩大胚胎数进一步验证效果。
[0044]本发明的有益效果，一是操作简单，适合高通量筛选，利用96孔板可进行高通量的药物筛选和验证工作；二是所述方法可以在更为接近真实人体环境中揭示药物和药物靶点的相互作用，大大的提高成药的概率；三是可视性强，表型直观明确，所述方法可以利用Morpholino寡聚核苷酸序列使斑马鱼Shh信号通路过表达，且能将这一不易检测的指标转化为特异的、易于被肉眼观察的体轴向背侧弯曲的表型，对筛选抑制Shh信号通路的药物带来极大便利；四是实验精度高，提高药物筛选效率。
【附图说明】
[0045]图1中Tulp3M0组为Morpholino寡聚核苷酸注射后38h时相的斑马鱼表型图，可以直观的看到体轴向背侧弯曲，并且体节呈现“U-shape”的Shh通路异常表达的特异性表型。
[0046]WT组是未注射Morpholino寡聚核苷酸的正常斑马鱼38h时相的表型图。
[0047]图2中WT为未注射Morpholino寡聚核苷酸的斑马鱼38h时相正常表型群体观。
[0048]Tulp3M0-wild是Morpholino寡聚核苷酸注射后38h时相温和表型群体观，表型一致性程度很高，可辨识度高。
[0049]Tulp3MO-severe是Morpholino寡聚核苷酸注射后38h时相严重表型群体观。
[0050]图3为注射Morpholino寡聚核苷酸的斑马鱼以正常，温和和严重三个程度作为区分得到的统计结果:严重表型占该组的近百分之二十，温和表型超过百分之四十，有表现的总比例接近百分之六十。
[0051]图4为将斑马鱼胚胎注射Mo