一种检测胎儿三倍体的引物组、方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用母体外周血中血浆游离DNA以检测 胎儿三倍体的产品、方法及试剂盒，即利用PCR技术和测序技术，对来自母体外周血的游离 DNA进行检测，从而判断胎儿是否为三倍体。
【背景技术】
[0002] 胎儿染色体的非整倍性检测是重要的产前检查之一 [1'2]。目前产前检查包括筛查 和诊断。筛查包括分析血清标志物、胎儿超声检测（如胎儿颈项透明层厚度的超声测量)， 但敏感性和特异性还有待提高 [1]。诊断检测包括有创的绒毛膜取样（chorionicvillus sampling，CVS)或羊膜穿刺术。目前的筛查方法的准确度还不是令人满意，因此还不能用 于普查。诊断检测虽然准确度高，但由于是有创的，有导致健康胎儿流产的风险 [3]。
[0003] 在过去的几十年，研宄人员们致力于开发一种母体血液检查技术来提高胎儿染色 体非整倍性检测的准确性和安全性。最初是想从孕妇的循环血液中分离出胎儿细胞并对其 进行分析，但结果不可靠，因为无法从母体血液中获取足够多的胎儿细胞+ 6]。最近由于提 取母体外周血中游离DNA(cell-freeDNA，cfDNA)技术的进步，对胎儿染色体数目异常进 行检测的技术得到了明显提高。cfDNA中除了来自母体的DNA外，还有来自胎儿的DNA。因 此通过分析来自胎儿的DNA可以判断胎儿的染色体状态。一些研宄人员已经成功运用大规 模平行DNA鸟枪测序法分析母血中游离DNA方法来判断胎儿是否有21-三体综合症、18-三 体综合症和13-三体综合症[7_ 11]。
[0004] 尽管大规模平行DNA鸟枪测序法的技术性能过硬，但是这项技术花费颇高且流程 和数据分析很繁杂，因为运用大规模平行DNA鸟枪测序法分析所有染色体上的随机基因 组片段时会产生大量不需要的测序数据。例如，在一项需要测定胎儿是否有21三体综合 症的研宄中读取每个样本平均会产生10, 800, 000个测序结果，但是平均只会用到32, 000 (0. 3%)个21染色体的测序结果来确定胎儿染色体的非整倍性[7]。
[0005] 最近报道了一种选定区域数字分析法（digitalanalysisofselectedregions， DANSR)，它将选择性分析游离DNA中特定的基因组片段[12]。通过选择性分析游离DNA，选定 区域数字分析法能够更有效地判断胎儿染色体是否出现非整倍态。在报道的方法中，研宄 者采用了 384对引物来扩增胎儿DNA。该法能准确判定胎儿是否有三体综合症。但由于引 物数量大，导致费用高和对PCR反应的条件要求高。
[0006] 综上所述，目前虽然有了选定区域数字分析法，但其费用较高，效率较低。开发费 用更低的方法能促进三体综合症无创筛查的普及，对提高我国的人口素质有重大意义。
[0007] 参考文献：
[1] ACOGPracticeBulletinNo. 77.Screeningforchromosomalaneuploidies. ObstetGynecol2007; 109: 217-27.
[2] NicolaidesKH.Screeningforfetalaneuploidiesat11to13weeks. PrenatDiagn2011; 31(1): 7-15.
[3] CaugheyAB，HopkinsLM，NortonME.Chorionicvillussampling comparedwithamniocentesisandthedifferenceintherateofpregnancyloss. ObstetGynecol2006; 108(3Pt1): 612-6.
[4] BianchiDW，SimpsonJL，JacksonLG,etal.Fetalgenderandaneuploidy detectionusingfetalcellsinmaternalblood:analysisofNIFTYIdata. NationalInstituteofChildHealthandDevelopmentFetalCellIsolationStudy. PrenatDiagn2002; 22(7): 609-15.
[5] GuettaE，SimchenMJ，Mammon-DavikoK，etal.Analysisoffetalblood cellsinthematernalcirculation:challenges,ongoingefforts,andpotential solutions.StemCellsDev2004; 13(1): 93-9.
[6] LoYM，ChiuRW.Prenataldiagnosis:progressthroughplasmanucleic acids.NatRevGenet2007; 8: 71-7.
[7] ChiuRW,ChanKC，GaoY，etal.Noninvasiveprenataldiagnosisof fetalchromosomalaneuploidybymassivelyparallelgenomicsequencingofDNAin maternalplasma.ProcNatlAcadSciUSA2008; 105(51): 20458-63.
[8] FanHC，BlumenfeldYJ，ChitkaraU,etal.Noninvasivediagnosisoffetal aneuploidybyshotgunsequencingDNAfrom[9]EhrichM，DeciuC，Zwiefelhofer T，etal.Noninvasivedetectionoffetaltrisomy21bysequencingofDNAin maternalblood:astudyinaclinicalsetting.AmJObstetGynecol2011; 204(3): 205.el-205,ell.
[10] SehnertAJ，RheesB，ComstockD，etal.Optimaldetectionoffetal chromosomalabnormalitiesbymassivelyparallelDNAsequencingofcell-free fetalDNAfrommaternalblood.ClinChem2011; 57(7): 1042-9.
[11] ChenEZ，ChiuRWK,SunH，AkolekarR，etal.Noninvasiveprenatal diagnosisoffetaltrisomy18andtrisomy13bymaternalplasmaDNAsequencing. PLoSOne2011; 6(7) :e21791.
[12] SparksAB，WangET,etal.Selectiveanalysisofcell-freeDNAin maternalbloodforevaluationoffetaltrisomy.PrenatalDiagnosis, 2012， 32， 1-7
[13] TukeyJW.ExploratoryDataAnalysis.Addison-Wesley:Reading Massachusetts1977.
[14] IrizarryRA,BolstadBM,CollinF,CopeLM,HobbsB,SpeedTP. SummariesofAffymetrixGeneChipProbeLevelData.NucleicAcidsRes2003; 31(4) :el5.
[15] ConoverWJ.PracticalNonparametricStatistics.JohnWiley&Sons:New York1971; 295-301.
[16] RoystonP.AnextensionofShapiroandWilkJsWtestfornormalityto largesamples.ApplStatist1982; 31: 115-24.
[17] LunFM，ChiuRW,AllenChanKC，etal.MicrofluidicsdigitalPCR revealsahigherthanexpectedfractionoffetalDNAinmaternalplasma.ClinChem2008; 54(10): 1664-1672.
[18]ChiuRW,AkolekarR，ZhengYWL,etal.Non-invasiveprenatal assessmentoftrisomy21bymultiplexedmaternalplasmaDNAsequencing:large scalevaliditystudy.BMJ2011; 342:c7401〇
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种利用母体外周血中血浆游离DNA检测胎儿三倍体的引 物组、方法及试剂盒，以克服目前现有技术存在的上述不足。
[0009] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现： 一种利用母体外周血中血浆游离DNA检测胎儿三倍体的引物组，所述DNA选自人类 21，18, 13号染色体，针对所述21，18, 13号染色体，分别设计有300对序列特异性引物，每对 所述序列特异性引物包括正向引物，反向引物和中间引物，所述序列特异性引物的序列编 号为SEQIDNO: 1-2700。
[0010] 进一步的，与序列特异性引物相结合的序列为核心序列，所述核心序列在5'端， 所述核心序列包括5-15个碱基的保护序列。
[0011] 进一步的，所述序列特异性引物组中，在延伸引物5'端增加有作为接头的碱基序 列。
[0012] 进一步的，所述序列特异性引物的每个位点均是以游离DNA的上一段特异性序列 为模板而得到的三段连续引物，所述三段引物连接后形成PCR模板。
[0013] 进一步的，所述序列特异性引物在目标染色体上的序列唯一。
[0014] 进一步的，所述序列特异性引物的退火温度相同。
[0015] 进一步的，所述编号为SEQIDN0:l-2700的序列特异性引物与编号为SEQID NO: 2701-2702的通用引物序列互补性最低。
[0016] 进一步的，所述编号为SEQIDNO:1-2700的序列特异性引物与具有多态性和染色 体拷贝数变异的序列不一致。
[0017] -种利用母体外周血中血浆游离DNA检测胎儿三倍体的方法，包括以下步骤： (1) 分离、提取母体外周血血浆中的外周血游离DNA，S卩cfDNA; (2) 针对人类21，18和13号染色体，分别设计300对序列特异性引物，每对所述引