一种27个植物转基因位点复合pcr扩增荧光检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种27个植物转基因位点复合PCR扩增荧光检测试剂盒，该系统可以 用于玉米、大豆、水稻和油菜转基因成分或品系鉴定。
【背景技术】
[0002] 转基因技术是指将人工分离并修饰过的基因导入生物体基因组中，引起生物体的 可遗传的性状修饰，得到转基因生物体（geneticallymodifiedorganism,GM0)。转基因 作物具有其抗虫、抗病、高产等特性，被认为可引导第二次绿色革命。
[0003] 迄今全球有至少28个国家在种植转基因作物，种植面积已超过1. 7亿公顷，2012 年转基因种子的销售额达到了 150亿美元。各个国家和地区对转基因作物及其深加工产品 中的转基因成分都有严格的检测标准和要求，转基因检测的市场巨大。快速、准确、灵敏的 检测方法将成为主流，特别对于目前的新品种不断流入市场，一些未知信息的样本检测，往 往需要多个试剂盒才能完成，不仅浪费了时间，还浪费了宝贵的样本。因此，本项目针对目 前市场上转基因检测试剂盒检测指标单一、假阴性率较高的现状，特别是对于未知信息的 样本，力求开发出一种多指标的检测手段，极大的提升检出率，保证人们的食品知情权。
[0004] 目前检测转基因成分主要有基于外源蛋白的检测和基于外源插入DNA的检测两 大类。基于外源蛋白的检测主要有ELISA法与试纸条法，由外源蛋白制备得到相应单抗或 多抗，以此检测产品中是否含有该特异性蛋白。与DNA为基础的检测方法相比较，该方法处 理简单，具有快速、简便等特点，但准确性与灵敏度不够。基于外源插入DNA的检测方法有 PCR技术与基因芯片技术，目前PCR技术是最主要的转基因检测方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是：提供一种通过复合扩增27个转基因位点的系统，快速、准确地 检测植物基因组中插入的外源片段，鉴定转基因品系；利用聚合酶链式反应在一个体系中 同时扩增多个转基因位点，提出一种27个植物转基因位点复合PCR扩增荧光检测试剂盒。
[0006] 技术方案：
[0007] -种27个植物转基因位点复合PCR扩增荧光检测试剂盒，包括有用于扩增如下27 个转基因位点的引物：N0S、BAR、Pat、CaMV35S、FMV35S、CP4-EPSPS、CrylAb、NPTII、GA21、 Zein、MIR604、Mon88017、Mon863、TC1507、NK603、BT176、Btll、TT51、Ms8、Lectin、Mon89788、 pe3-p印case、Rf3、Sps、Rt73、GTS-40-3-2 及CV127。
[0008] 所述引物序列及其在扩增体系中的浓度优选如下：
[0009] 表1用于扩增各转基因位点的引物序列及其在扩增体系中浓度
[0010]
【主权项】
1. 一种27个植物转基因位点复合PCR扩增荧光检测试剂盒，其特征在于，包括有用于 扩增如下27个转基因片断的引物：NOS、BAR、Pat、CaMV35S、FMV35S、CP4-EPSPS、CrylAb、 NPTII、GA21、Zein、MIR604、Mon88017、Mon863、TC1507、NK603、BT176、Btll、TT51、Ms8、 Lectin、Mon89788、pe3_pepcase、Rf3、Sps、Rt73、GTS-40-3-2及CV127。
2.根据权利要求1所述的27个植物转基因位点复合PCR扩增荧光检测试剂盒，其特 征在于，所述的引物序列是：NOS，SEQ ID NO. 1?2 ;BAR，SEQ ID NO. 3?4 ;Pat，SEQ ID NO. 5 ?6 ;CaMV35S, SEQ ID NO. 7 ?8 ;FMV35S, SEQ ID NO. 9 ?10 ;CP4-EPSPS, SEQ ID Nail?12;CryIAb，SEQIDN0.13?14;NPTII，SEQIDNai5?16;GA21，SEQIDNai7? 18 ;Zein，SEQ ID NO. 19 ?20 ;MIR604, SEQ ID NO. 21 ?22 ;Mon88017, SEQ ID NO. 23? 24 ;Mon863，SEQ ID NO. 25 ?26 ;TC1507，SEQ ID NO. 27 ?28 ;NK603，SEQ ID NO. 29 ?30 ; BT176，SEQIDN0.31?32;Btll，SEQIDN0.33?34;TT51，SEQIDN0.35?36;Ms8，SEQ 10勵.37?38;1^(：衍11，5￡0 10勵.39?40以〇1189788,5￡0 10勵.41?42卬63-口印〇&86， SEQ ID NO. 43 ?44 ;Rf3, SEQ ID NO. 45 ?46 ;Sps，SEQ ID NO. 47 ?48 ;Rt73, SEQ ID NO. 49 ?50 ;GTS-40-3-2 SEQ ID NO. 51 ?52 ;CV127, SEQ ID NO. 53?54。
3.根据权利要求1或2所述的27个植物转基因位点复合PCR扩增荧光检测试剂盒，其 特征在于，所述引物在扩增体系中的终浓度为：SEQ ID NO. 1?2 :0. 06剛；SEQ ID NO. 3?4 :0? 2剛；SEQ ID NO. 5?6 :0? 24剛；SEQ ID NO. 7?8 :0? 096剛；SEQ ID NO. 9?10: 0.2剛；SEQ ID NO. 11?12:0. 3剛；SEQ ID NO. 13?14:0. 064剛；SEQ ID NO. 15?16: 0? 06剛；SEQ ID NO. 17?18 :0? 24剛；SEQ ID NO. 19?20 :0? 24剛；SEQ ID NO. 21?22: 0? 064剛；SEQ ID NO. 23?24 :0? 18剛；SEQ ID NO. 25?26 :0? 22剛；SEQ ID NO. 27?28: 0? 18剛；SEQ ID NO. 29?30 :0? 18剛；SEQ ID NO. 31?32 :0? 033剛；SEQ ID NO. 33 ?34 : 0? 2剛；SEQ ID NO. 35 ?36 :0? 15剛；SEQ ID NO. 37 ?38 :0? 05剛；SEQ ID NO. 39 ?40 : 0? 3剛；SEQ ID NO. 41 ?42 :0? 24剛；SEQ ID NO. 43 ?44 :0? 25剛；SEQ ID NO. 45 ?46 : 0? 26剛；SEQ ID NO. 47 ?48 :0? 24剛；SEQ ID NO. 49 ?50 :0? 07剛；SEQ ID NO. 51 ?52 : 0? 2剛；SEQ ID NO. 53 ?54 :0? 3剛。
4.根据权利要求3所述的27个植物转基因位点复合PCR扩增荧光检测试剂盒，其特征 在于，所述的用于扩增27个转基因片断的引物中，至少有一条引物的5'端被标记。
5.根据权利要求4所述的27个植物转基因位点复合PCR扩增荧光检测试剂盒，其特征 在于，所述引物5'端被荧光标记。
6. 根据权利要求5所述的27个植物转基因位点复合PCR扩增荧光检测试剂盒，其特征 在于，所述引物分为三组进行荧光标记，N0S、BAR、Pat、CaMV35S、FMV35S、CP4-EPSPS、CryIAb 和 NPTII 为第一组；GA21、Zein、MIR604、Mon88017、Mon863、TC1507、NK603、BT176 和 Btll 为第二组；1"151、]\^8、1^(^111、]\1〇1189788、？63-?印。&86、1^3、5?8、财73、6丁5-40-3-2和（^127 为第三组。
7. 根据权利要求6所述的27个植物转基因位点复合PCR扩增荧光检测试剂盒，其特征 在于，每组引物使用6-FAM、HEX、TAMRA中任一种进行标记，且各组之间的标记色均不相同； 内标选用橙色突光标记，标记物为SIZ。
8. 根据权利要求1所述的27个植物转基因位点复合PCR扩增荧光检测试剂盒，其特征 在于，所述试剂盒的组成为：PCR缓冲液、MgCl 2、dNTPs和BSA，Taq酶，27对引物混合物及超 纯水。
9.根据权利要求1所述的27个植物转基因位点复合PCR扩增荧光检测试剂盒，其特征 在于，所述试剂盒的PCR扩增体系pH值为8. 0?9. 0,镁离子浓度为1. 5?3. 5mM，4种dNTP 的终浓度各为200?300剛，BSA在所述PCR扩增体系中的终浓度为0. 1?lmg/mL，Taq酶 的用量为〇. 1?〇. 4U/ML。
【专利摘要】本发明公开了一种27个植物转基因位点复合PCR扩增荧光检测试剂盒，该试剂盒包括PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs和牛血清蛋白的混合物，热启动快速Taq酶，27对引物混合物及超纯水。本发明只需对植物基因组DNA样本进行约80min的核酸扩增，即可检测是否存在试剂盒包含的转基因位点，适用于玉米、大豆、水稻和油菜转基因成分或品系鉴定，是一种快速、简便、经济、高效的转基因成分检测试剂盒。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104593504
【申请号】CN201510033935
【发明人】张明哲, 张晓峰, 陈曦, 陈笑梅, 郑卫国, 齐丽媛, 王艳芳, 葛海鹏, 郭育林
【申请人】无锡中德美联生物技术有限公司, 浙江省检验检疫科学技术研究院
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月22日