罗非鱼无乳链球菌特异性核酸探针斑点杂交检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种罗非鱼无乳链球菌特异性核酸探针斑点杂交检测试剂盒，属于水 产生物制品领域。
【背景技术】
[0002] 无乳链球菌（Streptococcusagalactiae)也称B群链球菌（GBS)，是一类广泛存 在于自然界的革兰氏阳性菌，宿主范围广，对哺乳类、爬行类、两栖类及鱼类均可造成危害。 1958年在日本养殖虹鳟（Oncorhychusmikiss)中首次发现了链球菌病，其后鱼类链球菌 病的报道逐渐增多。2009年以来，该病在我国多流行于养殖的罗非鱼，其感染性强，死亡率 高，治疗困难，如何在感染早期快速、准确、灵敏地检测无乳链球菌成为研宄的热点。
[0003] 目前罗非鱼无乳链球菌实验室检测方法包括常规的生化检测法，血清学检测法和 分子生物学检测法。常规生化检测主要建立在生物化学中的快速专有酶反应和细菌代谢产 物的检测技术，该方法耗时较长、阳性率低，对无乳链球菌早期快速批量筛查有一定的局限 性；血清学检测方法，其方法简便、快捷，但不能完全排除假阴性结果；分子生物学检测，实 验条件要求高，容易受到种种检测条件的影响，难以普及推广。LAMP环介导等温技术，简便 快速、灵敏度高，所需仪器也较简单，但对检测的实验环境及人员操作要求相对较高，可能 受人为误差因素影响，产生假阳性结果。
[0004] 因此现有无乳链球菌检测技术还有待于改进和发展，以满足不同阶层工作人员的 需求。
【发明内容】
[0005] 鉴于现有无乳链球菌检测技术的不足，本发明的目的在于提供一种罗非鱼无乳链 球菌的探针斑点杂交检测试剂盒，旨在解决现有的检测方法耗时长、阳性率低、条件高、易 受认为误差因素影响的问题。本发明所提供的试剂盒利用特异性地高辛核酸片段探针，能 同时鉴别性的检测大量样品中的罗非鱼无乳链球菌。通过对病料组织样品DNA提取物或细 菌样品的煮沸后的上清液进行斑点分子杂交，特异的检测样品中的无乳链球菌。
[0006]本发明所涉及的试剂盒是利用罗非鱼无乳链球菌cfb片段（序列1)为模板，用特 定引物（序列2和3)通过PCR合成了地高辛标记（Digoxiaenin，DIG)的探针。通过斑点 杂交，这些探针（Digoxigenin-labelledcfbprobe)可用于检测病料样品或菌株煮沸后的 上清液中无乳链球菌特异性核酸的存在，用于判定是否有无乳链球菌感染。利用这一方法， 在1张8x8cm大小的尼龙膜上可同时检测约80份病料或菌株的核酸样品。并可在16h? 24h内完成检测并报告结果。
[0007]本发明的详细描述
[0008](一）无乳链球菌地高辛标记探针的制备及验证
[0009] 1?无乳链球菌cfb片段（序列1)的扩增（用作非标记的对照DNA)
[0010] 模板：无乳链球菌菌株pEASY'_-T3-cfb克隆质粒（本发明人制备和测序并保 存），PCR反应体系如下：10xPCRbuffer(Mg+)，5yL;dNTPstocksolution(2mmol/L each), 5yL；Forwardprimer(10ymol/L)(序列 2)，5yL;Reverseprimer(10ymol/L) (序列 3)，5yL;Enzymemix(3. 5U/yL)，0? 75yL;DNA模板，1yL;ddH20, 28. 25yL。将上 述成分加入灭菌的PCR管中，混合均匀后，离心后置于PCR扩增仪，扩增程序为：94°C，5min; 94°C，30S，57°C，30s，72°C，lmin，32 个循环；72°C延伸lOmin;4°C保存备用。
[0011] 2.无乳链球菌cfb片段（序列1)PCR法制备地高辛标记探针
[0012] 以上pEASY'.-T3-cfb质粒DNA为模板进行PCR扩增，反应体系如下：10xPCR buffer(Mg+), 5yL；PCRDIGProbeSynthesismixture, 5yL；Forwardprimer(10ymol/ L)(序列 2)，5yL;Reverseprimer(10ymol/L)(序列 3)，5yL;Enzymemix(3. 5U/yL)， 0? 75yL;pEASYk-T3-cfb质粒DNA，1yL;ddH20,28. 25yL。将上述成分加入灭菌的PCR管 中，混合均勾，离心后置于PCR扩增仪，扩增程序为：94°C，5min;94°C，30S，57°C，30s，72°C，lmin，32个循环；72°C延伸lOmin;4°C保存备用。1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，并测序验证。
[0013] (以上模板用质粒DNA浓度，PCR终浓度要求为10pg?100pg;若用基因组DNA， PCR体系终浓度为lng?50ng)
[0014] (二）试剂盒组成
[0015] 1.探针
[0016] 试剂1 :地高辛标记的罗非鱼无乳链球菌cfb片段（序列1)探针，lyg/yL， 10yL?50yL/瓶。序列1 (471碱基）：
[0017] CAGTAATCAAGCCCAGCAAATGGCTCAAAAGCTTGATCAAGATAGCATTCAGTTGAGAAATATCAAA GATAATGTTCAGGGAACAGATTATGAAAAACCGGTTAATGAGGCTATTACTAGTGTTGAAAAATTAAAGACTTCA TTGCGTGCCAACCCTGAGACAGTTTATGATTTGAATTCTATTGGTAGTCGTGTAGAAGCCTTAACAGATGTGATT GAAGCAATCACTTTTTCAACTCAACATTTAGCAAATAAGGTTAGTCAAGCAAATATTGATATGGGATTTGGGATA ACTAAGCTAGTTATTCGCATTTTAGATCCATTTGCTTCAGTTGATTCAATTAAAGCTCAAGTTAACGATGTAAAG GCATTAGAACAAAAGGTTTTAACTTATCCTGATTTAAAACCAACTGATAGAGCTACCATCTATACAAAATCAAAA CTTGATAAGGAAATCTGGAATACACGCTT
[0018] 2.未标记的cfb片段对照DNA
[0019] 试剂2 :罗非鱼无乳链球菌cfb片段（471碱基的序列1)PCR扩增的DNA，10pg/yL， 50yL/ 瓶。
[0020] 3.PCR引物
[0021] 试剂3 :罗非鱼无乳链球菌特异性正向引物，5' -AAGCGTGTATTCCAGATTTCCT-3'（序 列2);
[0022] 试剂4 :罗非鱼无乳链球菌特异性反向引物，5' -CAGTAATCAAGCCCAGCAA-3'（序列 3) 〇
[0023] 4.尼龙膜8cmx8cm，20?100片（可根据样品多少，裁剪适合大小使用）
[0024] 5?其他试剂
[0025] 试剂5 :封闭试剂（购自Roche公司，Cat.No. 10%176,lg/瓶）
[0026] 试剂6 :碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体（购自Roche公司，10yL/瓶， anti-Digoxigenin-ApConjugate,Cat.No1093274)
[0027] 试剂7 :碱性磷酸酶发光底物（CSPDready-to-use)(购自Roche公司，Cat-No. 11755633001，lOOmL) 。
[0028]试剂 8 :杂交液颗粒（购自Roche公司，DIGEasyHybGranules，Cat. No.11796895001)
[0029] 6.自备试剂及耗材
[0030] 20XSSC溶液（3MNacl，0.03枸橼酸三钠，调整pH至7.0)，可封口塑料袋，尖头一 次性滴头，洗涤缓冲液（〇. 1M马来酸，0. 15MNaCl;pH7. 5 ;0. 3%v/v吐温20)，马来酸缓冲 液（0? 1M马来酸，0? 15MNaCl，pH7. 5)，检测缓冲液（0? 1MTris-HCl，0. 1MNaCl，pH9. 5)， 10XSDS溶液。
[0031] 7?设备
[0032] 水浴锅，压模机，5yL、100yL移液器。
[0033](二）试剂盒的操作方法：
[0034] 1.核酸样品的制备：
[0035] (1)上清液核酸样品：取2?5个待检测菌株菌落或lmL菌液离心后的沉淀菌株， 溶于100yL无菌水，100°C水浴15min，立即冰浴3min，稍离心，取上清备用。
[0036] (2)病料核酸样品：取发病罗非鱼待检组织脑或肝脏，利用基因组提取试剂盒 DNeasyblood&TissueKit提取基因组，保存备用；必要时也可以基因组为模板，利用引物 2和3对基因组进行PCR扩增（反应体系：；扩增程序：94°C，5min;94°C，30S，57°C，30s， 72°C，lmin，32个循环；72°C延伸10min;)，扩增产物无凝胶需电泳确认，可直接保存备用。
[0037]2.杂交及免疫检测：
[0038] (1)取2UL核酸样品（上述上清液或基因组或PCR产物），点样于适当大小的尼 龙膜上（尼龙膜划好格子，长和宽做好标记）。
[0039] (2)在2xSSC中简单洗膜，120°下烘烤尼龙膜30min。（可保存于4°C)
[0040] (3)将上述转膜好的尼龙膜（点样面朝上）放入适量体积的DIGEasyHyb缓冲液 (事先预热至40°C)，温和震荡30min，进行预杂交。
[0041] (4)取适量地高辛标记的DNA探针，沸水浴中变性5min，后立即置于冰上冷切。将 变性的地高辛标记探针加入到预热的DIGEasyHyb缓冲液中，充分混匀，避免产生气泡。 (杂交液中探针终浓度约为25ng/mL)
[0042] (5)倒出（3)中预杂交液，在膜上加入⑷中的探针杂交液，40°C温和震荡孵育至 过夜。
[0043] (6)用足量的2XSSC，0. 1%XSDS在室温（15°C?25°C)连续振荡洗膜两次，每 次 5min〇
[0044] (7)用足量的0?5XSSC，0. 1%XSDS(预热到洗涤温度）