一种用于猪圆环病毒检测的方法及引物组的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明的领域涉及一种猪圆环病毒的检测的方法，尤其涉及一种在轮状病毒疫苗 中检测猪圆环病毒的方法。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属，病毒粒子大小为14?25nm，平均直 径17nm，呈对称的二十面体，无囊膜，基因组为单股环状DNA。其在组织中的悬浮密度为 1. 37cm3,沉降系数为52S，是目前发现的最小的动物病毒。PCV对外界的抵抗力较强，该病 毒对氯仿不敏感，不凝集牛、羊、猪、鸡等多种动物和人的红细胞。
[0003] 根据致病性、抗原性和核酸序列的差异，PCV被分为PCV- 1和PCV- 2。PCV- 1无 致病性，1974年由德国学者Tischer从多株连续传代的PK-15细胞中最先发现，1982年证 实该病毒来源于当初制备PK-15细胞的猪肾组织。后来证实该病毒只是一种可以感染猪的 普通病毒，不会对感染猪造成危害。PCV-2却具有致病性，能引起猪表现多种临床症状。
[0004] 2010年3月22日，美国FDA宣布暂停GSK公司生产的轮状病毒疫苗Rotarix的使 用，因为在该疫苗存在猪圆环病毒1型（PCVl)DNA的污染。这一结论是在EricDelwart博 士的实验室采用称为深度测序Oeep sequencing)的新技术得到的。但是深度测序在应用 上也存在一定缺陷，这主要包括检测方法复杂、费用高昂等。
[0005] 同时，GSK和FDA随后进行的检测也证实了该疫苗中确实存在这种DNA。2010年5 月6日，FDA宣布RotaTeq(由默克公司生产）中查出含有猪圆环病毒I型（PCV1)以及猪 圆环病毒II型（PCV2)中的DNA片段。这两种疫苗原本有着极好的安全记录。目前为止， 还没有证据表明这2种疫苗中存在的PCV在人体中会引起感染，但是这种动物来源的病原 的存在终会是有风险的，这也提示对于疫苗质量的控制很重要。
[0006] 故如何在轮状病毒疫苗中有效检测猪圆环病毒，从而提高疫苗纯度成为了亟待解 决的问题。
【发明内容】
[0007] 本发明针对以上问题分别设计了I型和II型PCV的通用半巢式PCR引物及各型 PCV的特异性巢式PCR引物，建立了一种猪圆环病毒的检测方法，经序列测定证实该方法快 速、特异和有效。
[0008] 本发明的一方面在于提供一种猪圆环病毒的检测方法，其中猪圆环病毒包括I型 及II型病毒，该方法包括：
[0009] 对样品提取DNA，并进行第一PCR;以及
[0010] 就第一PCR所获得的扩增产物进行第二PCR，本申请提供了以下这些引物组，具体 为：
[0011] 第一PCR所使用的引物包括第一引物组，第二引物组及第三引物组，
[0012] 第二PCR所使用的引物包括第四引物组，第五引物组及第六引物组，
[0013]其中，
[0014] 第一引物组包括如SEQ NO: 1所示序列的上游引物，及如SEQ NO:2所示序列的下 游引物，
[0015] 第二引物组包括如SEQ NO: 3所示序列的上游引物，及如SEQ NO:4所示序列的下 游引物，
[0016] 第三引物组包括如SEQ NO:5所示序列的上游引物，及如SEQ NO:6所示序列的下 游引物，
[0017] 第四引物组包括如SEQ NO: 1所示序列的上游引物，及如SEQ NO:7所示序列的下 游引物，
[0018] 第五引物组包括如SEQ NO:8所示序列的上游引物，及如SEQ NO:9所示序列的下 游引物，
[0019] 第六引物组包括如SEQ NO: 10所示序列的上游引物，及如SEQ NO: 11所示序列的 下游引物。
[0020] 其中，前述检测的样品为轮状病毒口服活疫苗、3价轮状病毒重配疫苗、小牛血清、 培养基、细胞消化用胰酶、病毒消化用胰酶、和/或Vero细胞。
[0021] 其中，前述方法还包括对所述第二PCR扩增之后的产物进行定性分析。定性分析 包括用凝胶电泳显示所述第二PCR扩增之后的产物。
[0022] 本发明的另一方面在于提供一种用于猪圆环病毒检测的引物组，该引物组为通用 引物组，其可以检测包括I型和/或II型病毒在内猪圆环病毒，该引物组包括上游引物和 下游引物，所述上游引物包括如SEQ N0:1所示序列的上游引物，及如SEQ N0:2所示序列的 下游引物。
[0023] 本发明的另一方面在于提供一种用于猪圆环病毒检测的引物组，该引物组为通用 引物组，其可以检测包括I型和/或II型病毒在内猪圆环病毒，该引物组包括上游引物和 下游引物，所述上游引物包括如SEQ N0:1所示序列的上游引物，及如SEQ N0:7所示序列的 下游引物。
[0024] 本发明的另一方面在于提供一种用于猪圆环病毒检测的引物组，该引物组可以 检测包括I型猪圆环病毒，该引物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括如SEQ NO:5所示序列的上游引物，及如SEQ NO:6所示序列的下游引物。
[0025] 本发明的另一方面在于提供一种用于猪圆环病毒检测的引物组，该引物组可以 检测包括I型猪圆环病毒，该引物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括如SEQ NO:10所示序列的上游引物，及如SEQ NO:11所示序列的下游引物。
[0026] 本发明的另一方面在于提供一种用于猪圆环病毒检测的引物组，该引物组可以 检测包括II型猪圆环病毒，该引物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括如SEQ NO: 3所示序列的上游引物，及如SEQ NO:4所示序列的下游引物。
[0027] 本发明的另一方面在于提供一种用于猪圆环病毒检测的引物组，该引物组可以 检测包括II型猪圆环病毒，该引物组包括上游引物和下游引物，所述上游引物包括如SEQ NO:8所示序列的上游引物，及如SEQ NO:9所示序列的下游引物。
[0028] 本发明有以下特点：
[0029] 1.本发明所涉及的I型、II型通用引物是根据PCV1和PCV2都保守的区域设计 的，用此半巢式PCR引物对合成的PCV1片段以及PCV2细胞培养物均能扩增出260bp的特 异性片段。经过序列测定并比对后，其与其他PCV1毒株及PCV-II毒株同源性高（以PCV1 为模板扩增的片段与PCV1毒株的同源性在96%以上，以PCV2细胞培养物为模板扩增的片 段与II型PCV毒株的同源性高于97% )。
[0030] 2.另一方面，本发明的申请人设计出了PCV-I型特异性的巢式PCR引物，对合成的 PCV-I片段进行扩增，外引物和内引物都能扩增出相应预期大小的目的片段，经测序和序列 比对后与其他PCV1毒株的基因同源性高（均在99%以上）。
[0031] 3.另一方面，本发明的申请人设计出了PCV2特异性的巢式PCR引物，对PCV-II 片段进行扩增，获得的500bp的特异性片段经测序后，与其他2型PCV毒株的同源性高（在 98%以上）。
[0032] 4.本发明的另一方面在于提供了一种可在轮状病毒疫苗及其他辅助产品中检测 PCV-I及PCV-II的有效方法。
【附图说明】
[0033] 本发明将参考附图进行进