包括金属蛋白酶的洗涤剂组合物的制作方法

包括金属蛋白酶的洗涤剂组合物的制作方法
【专利说明】包括金属蛋白酶的洗涤剂组合物
[0001 ] 对序列表的引用
[0002] 本申请包括一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。 发明领域
[0003] 本发明涉及包括金属蛋白酶（E. C 3. 4. 24)的清洁和/或洗涤剂组合物。本发明 进一步涉及金属蛋白酶在清洁过程（例如餐具洗涤和衣物洗涤）中的用途。另外，本发明 涉及进行清洁（例如餐具洗涤和衣物洗涤）的方法。
[0004] 相关技术说明
[0005] 超过30年以来，洗涤剂工业已经在洗涤剂配制品中应用了不同酶，最常用的酶包 括蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶，每种酶适于除去不同类型的污物。除这些酶之外，洗涤剂组合 物典型地包括成分的复合物组合。例如，大多数清洁产品包括表面活性剂体系、漂白剂或助 洗剂。不管当前洗涤剂的复杂度如何，但是对于研发包括新的酶和/或酶共混物的新的洗 涤剂组合物仍存在需要。
[0006] 金属蛋白酶是对于其活性而言绝对需要金属离子的蛋白水解酶。大多数金属蛋 白酶都是锌依赖性的，尽管一些金属蛋白酶使用其他过渡金属。金属蛋白酶已经被广泛 地用于不同工业中，像食品和酿造工业。被最充分表征的金属蛋白酶组之一是嗜热菌蛋 白酶。嗜热菌蛋白酶属于M4家族金属蛋白酶并且已经用于例如肽合成过程中。对于此 类应用，嗜热菌蛋白酶需要在高温下具有活性并且已经聚焦于在高温下增加其性能。在 TO 2004/011619(斯特拉塔基因公司（Stratagene))中描述了具有改变的切割特异性的 嗜热菌蛋白酶样蛋白酶的耐热变体。另一种M4金属蛋白酶是解淀粉芽孢杆菌金属蛋白 酶,又称Neutrase?,其多年以来已经被用作不同食品和饲料产品中的添加剂,例如在酿 造中。此金属蛋白酶还已经被描述用于在洗涤剂和清洁组合物和过程中使用，如描述于例 如TO 2007/044993,储存稳定的金属蛋白酶在洗涤剂中的用途或WO 2009/058518,以及EP 1 288 282(联合利华（Unilever))中，其描述了一种用于在餐具洗涤中使用的金属蛋白酶 和丝氨酸蛋白酶的共混物。嗜热菌蛋白酶样金属蛋白酶在洗涤剂中的用途还被描述于WO 20099058303(丹尼斯克美国公司（Danisco US INC·))中。
[0007] 然而，金属蛋白酶在洗涤剂工业中的使用已经非常受限并且焦点已经聚于金属蛋 白酶Neutrase?:和/或"NprE"的使用，如TO 2007/044993中所阐述。通常，金属蛋白酶 在常规洗涤条件下以及在常规洗涤剂组合物中是非常不稳定的。因此，金属蛋白酶在洗涤 和清洁过程中以及在洗涤剂中的使用受限。
[0008] 对改进洗涤过程以便使得它们更环保的增加的聚焦导致如下全球趋势：降低洗涤 时间、pH和温度，减少可能负面地影响环境的洗涤剂组分的量。本发明针对这些以及其他 重要目的。
[0009] 发明概述
[0010] 本发明的一个方面涉及一种包括具有蛋白酶活性的多肽的组合物，其中具有蛋白 酶活性的该多肽选自：
[0011] a) -种多肽，该多肽与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO 4的成熟多肽具有至少70%序 列一致性，例如至少75%-致性，例如至少80%-致性，例如至少85%序列一致性，例如至 少90%-致性，例如至少95%-致性，例如至少97%-致性，例如至少98%-致性，例如至 少99 % -致性；
[0012] (b) -种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO 3的成熟多肽编码序列具有至少70%序列一致性，例如至少75%-致性，例如至少80% 一致性，例如至少85%序列一致性，例如至少90%-致性，例如至少95%-致性，例如至少 97%-致性，例如至少98%-致性以及例如至少99% -致性；
[0013] (c) 一种变体，该变体包括SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO 3的成熟多肽的一个或多个 (若干个）氨基酸的取代、缺失、和/或插入；以及
[0014] (d) (a)、（b)或（C)的多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性。
[0015] 在本发明的一个具体方面中，该组合物是一种清洁组合物，例如洗涤剂组合物或 洗涤剂添加剂。此外，本发明涉及根据本发明的组合物在清洁过程，例如衣物洗涤、硬表面 清洁、餐具洗涤或自动化餐具洗涤中的用途。
[0016] 本发明的另一个方面涉及具有蛋白酶活性的多肽在清洁过程中的用途，其中具有 蛋白酶活性的该多肽选自：
[0017] a) -种多肽，该多肽与SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO 4的成熟多肽具有至少70%序 列一致性，例如至少75%-致性，例如至少80%-致性，例如至少85%序列一致性，例如至 少90%-致性，例如至少95%-致性，例如至少97%-致性，例如至少98%-致性以及例 如至少99 % -致性；
[0018] (b) -种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO 3的成熟多肽编码序列具有至少70%序列一致性，例如至少75%-致性，例如至少80% 一致性，例如至少85%序列一致性，例如至少90%-致性，例如至少95%-致性，例如至少 97%-致性，例如至少98% -致性并且最优选至少99% -致性；
[0019] (c) 一种变体，该变体包括SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO 4的成熟多肽的一个或多个 (若干个）氨基酸的取代、缺失、和/或插入；以及
[0020] (d) (a)、（b)或（C)的多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性。
[0021] 本发明的分离的多肽是一种属于M4金属蛋白酶组的金属蛋白酶。优选地，该分离 的多肽来源于微小杆菌属。
[0022] 本发明涉及金属蛋白酶，特别是M4类型的金属蛋白酶，例如与SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4具有至少70%-致性的金属蛋白酶，在清洁过程，例如衣物洗涤和餐具洗涤中的用 途，并且特别地涉及在低温中的用途。本发明还涉及包括金属蛋白酶的洗涤剂组合物和清 洁组合物。
[0023] 本发明的一个具体方面涉及一种清洁方法，所述方法包括以下步骤：使表面与根 据本发明的金属蛋白酶接触。
[0024] 本发明的另一个具体方面涉及包括一种金属蛋白酶和一种表面活性剂的组合物， 例如洗涤剂组合物。
[0025] 本发明的又另一个具体方面涉及一种用于从表面除去污物的方法，该方法包括使 该表面与根据本发明的组合物接触。
[0026] 序列表综述
[0027] SEQ ID NO 1 :是西伯利亚微小杆菌（Exiguobacterium sibiricum)的 DNA 序列。
[0028] SEQ ID NO 2 :是如从 SEQ ID N0:1(SWISSPR0T :B1YFR1)推导的氨基酸序列。
[0029] SEQ ID NO 3 :是微小杆菌属ATlb的DNA序列。
[0030] SEQ ID NO 4 :是如从 SEQ ID N0:3(SWISSPR0T :C4L1B3)推导的氨基酸序列。
[0031] SEQ ID NO 5:编码具有被优化以用于在芽孢杆菌属菌株中进行表达的密码子使 用的西伯利亚微小杆菌金属蛋白酶的DNA。
[0032] SEQ ID NO 6:编码具有被优化以用于在芽孢杆菌属菌株中进行表达的密码子使 用的微小杆菌属ATlb金属蛋白酶的DNA。
[0033] SEQ ID NO 7 :正向引物序列
[0034] SEQ ID NO 8 :反向引物序列
[0035] SEQ ID NO 9 :西伯利亚微小杆菌的成熟多肽
[0036] SEQ ID NO 10 :微小杆菌属ATlb的成熟多肽
[0037] SEQ ID NO 11 :西伯利亚微小杆菌的N-末端序列
[0038] SEQ ID NO 12 :微小杆菌属ATlb的N-末端序列
[0039] SEQ ID NO Π :解淀粉芽孢杆菌蛋白酶 Uniprot :P〇6832 ( Neutrase? )
[0040] SEQ ID NO 14:克劳氏芽孢杆菌蛋白酶（Savinase? )
[0041] 定义
[0042] "具有蛋白酶活性的多肽"具有蛋白酶活性的多肽或蛋白酶有时还被指定为肽酶、 朊酶、肽水解酶或蛋白水解酶。蛋白酶可以是在其任一端开始水解肽的外切型蛋白酶或在 多肽链内部发挥作用的内切型蛋白酶（内肽酶）。内肽酶对N-和C-末端被封闭的肽底物 显示出活性，这些底物与所讨论的蛋白酶的特异性有关。
[0043] 术语"蛋白酶"在此被定义为水解肽键的酶。本发明提供了具有蛋白酶活性的多肽 在洗涤剂组合物中的用途。本发明还提供了编码这些多肽的多核苷酸。本发明的蛋白酶是 MEOPS家族M4的金属蛋白酶。本发明的这些多肽具有SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4的成熟 多肽的至少20 %，例如至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至 少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %以及至少100 %的蛋白酶活性。
[0044] 可以使用任何测定来测量"蛋白酶活性"，其中采用一种底物，该底物包括与所讨 论的蛋白酶的特异性相关的肽键。PH测定和温度测定同样适用于所讨论的蛋白酶。pH值 测定的实例是pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12。温度测定的实例是151：、201：、251：、 30°〇、351：、371：、401：、451：、501：、551：、601：、651：、701：、801：、901：、或951：。普通蛋白酶 底物的实例是胶原、酪蛋白、牛血清白蛋白以及血红蛋白。在经典的安森（Anson)和米尔斯 基（Mirsky)方法中，将变性的血红蛋白用作底物并且在用所讨论的蛋白酶孵育测定后，确 定三氯乙酸可溶的血红蛋白的量用作蛋白酶活性的量度（安森（Anson)，M.L.和米尔斯基 (Mirsky), A. E.，1932,普通生理学杂志（J. Gen. Physiol.) 16:59 以及安森（Anson), M. L., 1938,普通生理学杂志（J. Gen. Physiol.) 22:79)。
[0045] 出于本发明的目的，使用描述于"材料与方法"中的测定确定蛋白酶活性，如 Protazyme OL 测定。
[0046] 如在此使用的术语"金属蛋白酶"是指在结合/活性位点中具有一种或多种金属 离子的蛋白酶。
[0047] 如在此使用的术语"M4金属蛋白酶家族"或"M4金属蛋白酶"或"M4"意指根据罗 林斯（Rawlings)等人，生物化学杂志（Biochem.J.)，290, 205-218 (1993)并且如进一步描 述于 MER0PS_(罗林斯等人，MEROPS :肤酶数据库（MER0PS:the peptidase database)，核酸 研究（Nucl Acids Res)，第34期数据库，D270-272,2006)中，落入M4金属蛋白酶家族的多 肽。M4金属蛋白酶是主要包含内肽酶的中性金属蛋白酶。该家族中的所有肽酶都结合单个 的催化锌离子。M4金属蛋白酶家族成员包括常见的HEXXH基序，其中组氨酸残基充当锌配 体并且谷氨酸是活性位点残基。M4金属蛋白酶具有主要位于中性pH处的最优pH J4金属蛋 白酶家族包括例如Neutrase? (被分类为MEROPS亚类M04. 014)、嗜热菌蛋白酶、杆菌溶素 (Bacillolysin)、弧菌溶血素、假溶素（pseudolysin)、Msp 肽酶、球菌溶素（coccolysin)、 短梗霉溶素（aureolysin)、比梅溶素（vimelysin)、X毒素中性肽酶B、PA肽酶（气单胞菌 属类型）、格里塞溶素（griselysin)、硬脂溶素（stearolysin)、MprIII (交替单胞菌属菌株 0-7)、pap6肽酶、中性肽酶（热放线菌属类型）、ZmpA肽酶（伯克霍尔德菌属）、zpx肽酶、 PrtS肽酶（发光杆菌）、多变溶素（protealysin)、ZmpB肽酶（伯克氏菌属）。多肽的M4金 属蛋白酶家庭已经被进一步表征并且根据MER0PS，目前包括至少二十二个已经为其指定独 特MEROPS ID (即，具有式M04. XXX的标识符）的亚类以及非肽酶同系物和未指定的肽酶。
[0048] 如在此使用的术语"分离的多肽"是指从来源分离的多肽。在一个方面中，该变 体或多肽是至少20%纯的，更优选至少40%纯的，更优选至少60%纯的，甚至更优选至少 80%纯的，最优选至少90%纯的并且甚至最优选至少95%纯的，如通过SDS-PAGE所确定。
[0049] 术语"基本上纯的多肽"在此指一种包含按重量计至多10%，优选至多8%，更优 选至多6 %，更优选至多5 %，更优选至多4 %，更优选至多3 %，甚至更优选至多2 %，最优选 至多1 %，并且甚至最优选至多0. 5 %的该多肽和与其天然地或重组地相关的其他多肽材 料的多肽制剂。因此，优选的是该基本上纯的多肽按存在于该制剂中的所有多肽材料的重 量计是至少92%纯的，优选至少94%纯的，更优选至少95%纯的，更优选至少96%纯的，更 优选至少97%纯的，更优选至少98%纯的，甚至更优选至少99%纯的，最优选至少99. 5% 纯的，并且甚至最优选100%纯的。本发明的多肽优选处于基本上纯的形式。其可通过，例 如，以公知的重组方法或以经典的纯化方法制备该变体或多肽而达成。
[0050] 术语"成熟多肽编码序列"意指编码具有蛋白酶活性的成熟多肽的多核苷酸。
[0051] 两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数"序列一致性"描 述。出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（尼德曼和翁施， 1970,分子生物学杂志（J. Mol. Biol. )48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的一致性 程度，该算法如EMBOSS软件包（EMBOSS :欧洲分子生物学开放软件套件（The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯（Rice)等人，2000,遗传学趋势（Trends in Genetics) 16:276-277 ;http://emboss, org)(优选 3· 0· 0 版或更新版本）的尼德尔 (Needle)程序所实施的。所使用的这些任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5， 及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本）取代矩阵。尼德尔标注的"最长的一致性"的输 出（使用-非简化选项获得）被用作百分比一致性，并且如下计算：
[0052] (一致的残基X 100V (比对长度-比对中的空位总数）
[0053] 出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :欧洲分子生物学开放软件套件， 赖斯等人，2000,见上文；http://emboss, org)(优选3. 0. O版或更新版本）的尼德尔程序 中所实施的尼德尔曼-翁施算法（尼德尔曼和翁施，1970,见上文）来确定两个脱氧核糖 核苷酸序列之间的一致性程度。所使用的这些任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分 0. 5,及EDNAFULL (NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本）取代矩阵。尼德尔标注的"最长的一致性" 的输出（使用-非简化选项获得）被用作百分比一致性，并且如下计算：
[0054] (一致的脱氧核糖核苷酸X 100V (比对长度-比对中的空位总数）
[0055] 术语"片段"意指使一个或多个（若干个）氨基酸从成熟多肽的氨基和/或羧基 末端缺失的多肽；其中该片段具有蛋白酶活性。
[0056] 术语"多肽的功能片段"或"其功能片段"用来描述衍生自更长的多肽（例如，成 熟多肽）的多肽，以及已经在N-末端区或C-末端区或两个区域中截短以产生亲本多肽的 片段的多肽。为了成为功能多肽，该片段必须保持全长/成熟多肽的至少20%，优选至少 40%，更优选至少50%，更优选至少60%，更优选至少70%，更优选至少80%，甚至更优选 至少90 %，最优选至少95 %，并且甚至最优选至少100 %的蛋白酶活性。M4金属蛋白酶可以 被截短，这样使得某个结构域被除去以产生一个功能片段，该功能片段可以是其中少于200 个氨基酸已经从成熟M4金属蛋白酶中除去，优选少于150个氨基酸，更优选少于120、100、 80、60、40、30个氨基酸，甚至更优选少于20个氨基酸并且最优选少于10个氨基酸已经从成 熟多肽中除去的多肽。
[0057] 术语"子序列"意指使一个或多个（若干个）核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端 和/或3'端缺失的多核苷酸，其中该子序列编码具有蛋白酶活性的一个片段。
[0058] 术语"等位基因变体"意指占用同一染色体位点的一种基因的两个或更多个替代 形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突 变可以是沉默的（在所编码的多肽中没有改变）或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。 多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
[0059] 术语"变体"意指在一个或多个（若干个）位置包含改变（即，一个或多个（若干 个）氨基酸残基取代、插入和/或缺失）的具有蛋白酶活性的多肽。取代意指将占据某个 位置的氨基酸替换为不同的氨基酸；缺失意指去除占据某个位置的氨基酸；并且插入意指 邻近占据某个位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。
[0060] 术语"清洁组合物"和"清洁配制品"是指用于从有待清洁的物品上除去不希望的 化合物的组合物，这些物品是例如织物、地毯、餐具（包括玻璃器皿）、接触镜、硬表面（例如 瓷砖、锌（zincs)、地板和桌面）、头发（香波）、皮肤（肥皂和面霜）、牙齿（漱口剂、牙膏） 等。这些术语涵盖针对具体类型的所希望的清洁组合物和产品的形式（例如，液体、凝胶、 颗粒或喷雾组合物）所选的任何材料/化合物，只要该组合物与用于该组合物中的金属蛋 白酶以及其他一种或多种酶可相容即可。通过考虑有待清洁的表面、物品或织物，以及针对 使用过程中的清洁条件的组合物的所希望的形式而容易地具体选择清洁组合物材料。这些 术语进一步是指适于清洁、漂白、消毒、和/或灭菌任何物品和/或表面的任何组合物。其 意图是，这些术语包括但不限于洗涤剂组合物（例如，液体和/或固体衣物洗涤剂和精细织 物洗涤剂；硬表面清洁配制品，如用于玻璃、木材、陶瓷和金属台面以及窗户；地毯清洁剂； 炉灶清洁剂；织物清新剂；织物柔软剂；和纺织品和衣物预去污剂，以及餐具洗涤剂）。
[0061] 除非另有说明，术语"洗涤剂组合物"包括颗粒状或粉状的全效或重垢清洗剂，尤 其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊状的全效清洗剂，尤其是所谓的重垢液（HDL)类型；液体 细薄织物洗涤剂；手洗餐具清洗剂或轻垢