用于蛋白质顺磁标记的乙二胺四乙酸类探针的合成方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白质顺磁标记领域，特别是一种用于蛋白质顺磁标记的乙二胺四 乙酸类探针的合成方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，高分辨顺磁核磁共振在生物大分子等结构生物学的研究中发挥的作用 日益重要。此技术通过顺磁中心的未配对电子与蛋白质分子自旋核的相互作用来提供 丰富的长程结构限制信息，如顺磁弛豫增强（paramagnetic relaxation enhancement, PRE)、贋接触化学位移（pseudocontact shifts，PCS)、残余偶极稱合（residual dipolar couplings，RDC)，利用这些顺磁信息，我们可以进一步研究生物大分子的空间结构、生物功 能以及分子之间的相互作用（（a) 7；沿乂眉2010，46: 101-112. (b)也/W Tfer 沒2010，39: 387-405. (c) CXewTfee 2009，109(9): 4108-4139. (d) 邏？ Spectr, 2002, 40: 249-273 )〇
[0003] 由于大多数蛋白质没有顺磁中心，为获得上述顺磁信息就需要借助合适的双功能 顺磁探针，并通过与蛋白质定点连接来实现。连接后，由于顺磁效应，顺磁中心附近氨基酸 残基的化学环境会发生较大的变化，导致核磁共振谱峰的化学位移亦发生明显改变，进而 得到PCS、PRE或RDC等相关顺磁数据。由此看来，双功能顺磁探针的设计与合成在蛋白质 顺磁研究中尤为重要/#期7? Tfeso/?, 2014，31(2)，155-171)。
[0004] 通过有机化学手段合成的双功能顺磁探针通常由以下两个不同的单元构成：1) 一 个具有很强金属离子螯合性能的基团；2)-个可与蛋白质定点连接的活性反应基团。前者 可以螯合具有不同顺磁物理特性的金属离子(如镧系金属离子，过渡金属离子)，即顺磁中 心；后者与蛋白质上唯一的活性氨基酸残基(如半胱氨酸、非天然氨基酸）反应，可达到对蛋 白质定点选择性标记的目的，从而进一步用于蛋白质顺磁研究。
[0005] 为获得良好的顺磁数据，在设计探针时，含有多氨基多羧基的螯合配体常被用 作为理想顺磁探针的基本骨架。从探针的骨架结构出发，又可将其划分为两大类，一 类以非环状结构的乙二胺四乙酸（EDTA)、二乙烯三胺五乙酸（DTPA)、2,6-吡啶二甲氨 基-N，N，N' K -四乙酸（PyMTA)等衍生物为主，另一类以环状结构的1，4, 7, 10-四氮杂环 十二烷-1，4, 7, 10-四乙酸（DOTA)等衍生物为主，这些探针均可与顺磁金属离子配位形成 热力学稳定的配合物。图1中列出了已报道的部分代表性的顺磁探针。
[0006] Gaponenko 等人（J 沿 〇?〇/·眉2002，24: 143 - 148)将已商业化的 EDTA 系 列探针，即图1中的化合物L-1，通过活化巯基的方法定点标记到目标蛋白质。其中，EDTA 作为配位化学中应用广泛的有机螯合配体，可与金属离子稳定结合。他们使用此探针在滴 加 Co2+和Yb 3+后，成功获得了 PCS和RDC数据，并得到溶液中对称二聚体蛋白质中每个单体 的结构信息。
[0007] Prudgncio 等人（泛6?·及/r. 7；，2004，10: 3252 - 3260)报道了 DTPA 系列探 针，即图1的化合物L-2,此类探针具有8个螯合位点且与顺磁金属离子形成非常稳定的配 合物。此外，它包含两个活性巯基，由DTPA双酸酐与S-(2-氨乙基）甲基硫代磺酸反应得 至IJ，可以和目标蛋白质上距离8~1〇Α的两个半胱氨酸残基同时反应，生成两个二硫键，从而 增强了探针的刚性，限制了探针与蛋白质间的相对运动，避免了 PCS平均化，但两个半胱氨 酸残基的位置需仔细斟酌，含有多个半胱氨酸的蛋白质在表达和纯化过程中也有可能二聚 或沉淀。在与蛋白质连接，滴加顺磁金属离子后，其NMR谱图至少有5套信号峰，HSQC谱图 非常复杂，难于分析。故此探针常用于获得PRE作为限制条件来研究蛋白质结构。
[0008] Graham 等人（沿oco/u·收ate 泛6?· 2011，22，2118-2125)报道了 DOTA 大环类 探针，即图1中的化合物L-3,这种大环化合物具有较为特殊的空间构象，可与顺磁金属离 子形成高配位化合物，对称性高，结合紧密，具有高度热力学稳定性，可有效减少非特异性 反应发生，获得较大的PCS，但形成配合物的过程较为缓慢，通常需要长时间的加热或回流 才能制备。相比之前的DOTA类探针，它在氮原子上引入了手性官能团，可获得更好的动力 学惰性和更少的非对映异构体，即环上氮原子与金属离子配位后不会表现出手性问题，避 免出现多套峰而造成NMR谱图复杂化。
[0009] Su 等人（泛6?·及/r. 7； 2013，19，1097 - 1103)报道了化合物 4VPyMTA，即图 1 中的化合物L-4。此探针自身具有高化学稳定性，通过活性双键与蛋白质中的巯基选择性反 应连接。它具有七个螯合位点，可与顺磁金属离子形成七配位化合物，结合非常紧密。尽管 它与巯基的反应速率较慢，但在多数情况下，它更具有选择性，且连接后非常稳定，可用于 原位分析蛋白结构。此外，它刚性强，与金属离子配位后构象单一，不存在手性问题，可获得 干净和高品质的顺磁核磁谱图，便于数据分析。
[0010] 综上，在设计与合成一个性能优越的双功能顺磁探针时，需综合考虑以下几方 面： 1)对顺磁金属离子具有很强的螯合能力。顺磁金属离子一般可形成多配位化合物，其 中镧系金属离子的配位数高达8-9个，因此顺磁探针需要有多个螯合位点与之结合，使顺 磁中心刚性增强，提高NMR谱图的分辨率。此外，被螯合金属离子应接近蛋白质表面，距离 太远将不利于蛋白质顺磁核磁研究。
[0011] 2)体积较小，刚性连接。若顺磁探针体积较大，会因空间位阻等原因造成连接效率 低或无法连接，在一定程度上也会影响蛋白质的结构与功能；若与蛋白质连接后刚性不强， 对蛋白质会出现相对运动，则会造成PCS和RDC明显降低。
[0012] 3)没有手性，构象单一。顺磁探针和顺磁金属离子配位后若产生多个非对映异构 体，NMR谱图中会因出现多套峰，导致谱图复杂而难以分析。
[0013] 4)水溶性良好。水溶性好的顺磁探针能更好的在生理条件下对蛋白质进行定点修 饰。
[0014] 当然，对顺磁探针而言，与蛋白质连接一端活性基团的优化也极为重要，在以 往的研究中，通过二硫键将含有活化巯基的探针与蛋白质连接的方法应用最为广泛 泛￡皿5bc.，2009，131: 14761 - 14767)。此外，巯基与缺电子烯烃的硫醇烷基化 也能达到很好的连接效果，同时也突破了二硫键连接时连接产物在还原条件下不稳定的 限制（泛￡?.及