一种细胞因子颗粒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程领域，尤其涉及利用生物工程技术制备的细胞因子颗粒及其 在体外刺激单核细胞分化与扩增的应用。
【背景技术】
[0002] 免疫细胞治疗技术的发展使免疫科学的应用发生重大变化，其针对肿瘤的疗效正 在改变肿瘤患者的生存期和生存质量。例如，自体免疫细胞疗法，通过从肿瘤患者外周血中 分离出单个核细胞，使用含有针对性的刺激因子的培养液，刺激淋巴细胞的增殖和分化，使 其数量增多并具备抗瘤特异性，然后回输到肿瘤患者体内，对肿瘤有明显的治疗效果。这些 应用的免疫细胞包括：LAK细胞，TIL细胞，CIK细胞，T细胞，NK细胞，DC细胞，DC-CIK细胞 等。
[0003] 体外淋巴细胞分化和扩增的效率取决于刺激因子，其中以细胞因子为主。对于一 定数量的单个核细胞，不同的刺激方法和不同的细胞因子会使刺激效率造成较大差异，差 异包括淋巴细胞增殖所需要的时间，细胞状态和活力。一般地，使用常规细胞因子蛋白刺激 单个核细胞，因为细胞因子蛋白通常是小分子蛋白，对细胞的刺激作用较缓慢，而细胞增殖 缓慢，会导致所获得的细胞总量中老化细胞所占的比例升高，从而影响整体细胞的状态和 活力。因此，使细胞较快速度增殖，提高细胞整体状态的一致性，是保证整体细胞状态和活 力的有效办法。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术的细胞因子蛋白单独作用效果较弱的不足，本申请进行了研宄，寻 求一种改善的刺激单个核细胞分化与扩增的方法，及其中利用的细胞因子颗粒。
[0005]为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
[0006] 本发明提供一种细胞因子颗粒，其中，所述颗粒包括细胞因子和gag蛋白。
[0007] 优选的，所述颗粒的表面负载或展示所述细胞因子。优选的，所述颗粒通过细胞分 泌的方式形成。
[0008] 优选的，所述颗粒还包括共刺激分子。更优选的，所述共刺激分子为CD137L。
[0009] 优选的，所述的细胞因子，可以是一个或者多个。
[0010] 优选的，所述的细胞因子，包括但不限于白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落 刺激因子、生长因子和/或趋化性细胞因子。更优选的，所述细胞因子是白细胞介素。
[0011] 本发明还提供一种表达载体系统，其中所述表达载体系统包括（1)包含重组蛋白gag基因序列的载体和（2)包含细胞因子基因序列的载体。
[0012] 优选的，所述表达载体系统还包括共刺激分子基因。更优选的，所述共刺激分子为CD137L。
[0013] 优选的，所述载体是质粒。更优选的，所述质粒为真核表达载体pCMV。
[0014] 优选的，所述的细胞因子，可以是一个或者多个。
[0015]优选的，所述的细胞因子，包括但不限于白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落 刺激因子、生长因子和趋化性细胞因子。更优选的，所述细胞因子是白细胞介素。
[0016]本发明还提供一种宿主细胞，其中，所述宿主细胞包含上述表达载体系统。优选 的，所述宿主细胞表达细胞因子和gag蛋白，通过细胞分泌形成包含细胞因子和gag蛋白的 颗粒。更优选的，所述颗粒还包含共刺激分子。更优选的，所述共刺激分子为CD137L。
[0017]优选的，所述的宿主细胞选自293T，293，A549等。
[0018] 优选的，将所述表达载体系统导入宿主细胞中。优选的，所述的导入方法，包括但 不限于磷酸钙转染，脂质体转染，阳离子转染、电穿孔转染，病毒载体导入，显微注射。
[0019]本发明还提供一种上述细胞因子颗粒的制备方法。
[0020] 优选的，所述制备方法，包括将上述的宿主细胞在合适的条件下表达，通过细胞分 泌形成颗粒。
[0021] 优选的，颗粒上的表面可以负载和展示一种或多种细胞因子。
[0022] 优选的，所述的gag基因序列如SEQIDNO. 1或SEQIDNO. 2所示。
[0023]本发明还提供一种上述细胞因子颗粒在制备刺激单个核细胞分化和扩增试剂中 的应用。
[0024]本发明还提供一种上述细胞因子颗粒在刺激单个核细胞分化和扩增中的应用。优 选的，所述应用在体外进行。更优选的，所述应用不是治疗方法。
[0025]本发明还提供一种刺激单个核细胞分化和扩增的方法，将上述细胞因子颗粒体外 对单个核细胞进行刺激。优选的，所述方法不是治疗方法。
[0026]优选的，根据不同的细胞因子组合可用于刺激单个核细胞分化成不同的免疫细胞 类型，其中包括NK细胞和/或T细胞。
[0027]本发明通过颗粒作为细胞因子的载体，能够改善细胞因子对单个核细胞的刺激效 果，提高细胞因子的刺激效率。明显提高单个核细胞分化和扩增NK细胞或T细胞的数量， 同时，NK细胞或T细胞分泌的细胞因子的数量和靶细胞杀伤率显著提高。一方面，本发明的 细胞因子颗粒可以用于刺激单个核细胞分化和扩增，另一方面，根据分化的免疫细胞类型 不同，而分泌不同的具有更强活性的细胞因子，即可以用于制备细胞因子，例如细胞因子颗 粒刺激单个核细胞分化和扩增NK细胞或T细胞，随后NK细胞或T细胞分泌干扰素和肿瘤 坏死因子，即本发明的细胞因子颗粒也可用于制备干扰素和肿瘤坏死因子等细胞因子。并 进一步应用于临床或者研宄。
【附图说明】
[0028] 图1制备质粒示意图
[0029] 图2实施例3中PBMC增殖细胞计数
[0030] 图3实施例3中NK细胞杀伤活性
[0031] 图4实施例4中PBMC增殖细胞计数
[0032] 图5实施例4中NK细胞杀伤活性
[0033] 图6实施例5中PBMC增殖细胞计数
[0034] 图7实施例5中T细胞杀伤活性
【具体实施方式】
[0035] 下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
[0036] 实施例1 :表达载体系统制备
[0037] 1、重组蛋白gag质粒的制备
[0038] (1)核酸提取获得gag基因的RNA :使用QIAGEN公司QIAamp Ultrasens virus试 剂盒对鼠白血病病毒MLV的核酸进行提取。
[0039] 具体方法：取Iml病毒样品至2mlEP管并平衡温度至15 °C-25 °C，加800yl BufferAC，加5. 6yIcarrierRNA到EP管盖子里，然后漩涡振荡IOs混匀；室温培育10 分钟，3200rpm离心3分钟，弃去全部上清；加300ylBufferAR(60°C预热）加20yl蛋白 酶K，漩涡振荡使沉淀全部溶解；40°C水浴10分钟期间漩涡振荡一次5秒钟，将其全部移入 QIAampSpinColumn6000rpm离心 1 分
[0040] 钟弃去废液；加500yIBufferAWl7500rpm离心1分钟弃去废液，加500y1 BufferAW2 15000rpm离心3分钟弃去废液，加30yIBufferAVE7500rpm离心1分钟，收 集含RNA洗脱液，-20°C保存。
[0041] (2)逆转录RNA为cDNA:用Invitrogen逆转录试剂盒（SuperScriptII)对抽提 的病毒RNA进行逆转录
[0042] 具体方法：取I. 5ml离心管，加去离子水5y1、随机引物（IOuM)Iy1、样品RNA 5y1、dNTPmix(lOmM)Iy1，65°C孵育 5 分钟后置于冰上，加 5XFirst-strandBuffer 4yl、0.1M、DTT2yl、RNase0UTlyl，25°C孵育 2 分钟，加SuperScript?IIRTlyl，25°C 孵育10分钟，42°C孵育50分钟，70°C孵育15分钟，取2yI逆转录产物进行PCR扩增。
[0043] ⑶扩增cDNA中的gag基因的PCR产物：分别使用
[0044] F-primer:TCACCGTCGTCGACGAATTCGCCACCATGGGCCAGGCTGTTACCAC(SEQ ID NO. 3)
[0045] R-primer:GCCTGGTCTAGAGCGGCCGCTCATTACTCATCTTCTATGTTTAGGGTCAGC(SEQ ID NO. 4)
[0046]两对引物，PCR扩增gag片段。PCR反应体系：10XHigh Fidelity PCRBuffer 5 y I；10mM dNTP mixture Iyl；50mM MgSO4 2 y I ；Primer IOuM Forward/Reward I y I； Platinum Taq High Fidelity 0.5 y 1(2. 5unit);水37. 5 y I;逆转录产物2 y 1。总反应 体积50 y1。反应条件：94°C2分钟；94°C30秒，65°C40秒，72°C1分钟，30个循环；72°C3 分钟。
[0047] (4)构建gag质粒
[0048]用SacI线性化pCMV载体（质粒载体示意图见图I)，gag基因的PCR产物，分别 进行1%琼脂糖电泳〇^电泳缓冲液：1'1^108克、似260了4*21120 7.44克、硼酸55克， 去离子水定容至1L);切下回收目标片断和载体至以称重的1.5mlEP管中，用QIAEXIIGel ExtractionKit纯化：加入3倍体积的BufferQXl(IOOmg加 300yIQX1)。加 30yIBuffer QIAEXII然后50°C水浴10分钟，期间每两分钟漩涡振荡一次。13000rpm离心30秒，弃去 上清，加500yIQIAEXI洗一次，加BufferPE500y1洗两次弃去上清，空气干燥15分钟 直至沉淀变白。加入20yITE漩涡振荡30秒培育5分钟，13000rpm，离心30秒将上清移入 I. 5mlEP管，测量浓度。
[0049] 根据Infusion技术原理，线性化pCMV载体两端与gag基因片段两端有15?25个 碱基重合，Infusion技术能使其根据重合部分定向拼接。使用Clonetech公司的Infusion试剂盒，具体操作如下：5X In-Fusion buffer 2yl，EnzymeIy1，线性化pCMV载体， gag基因的PCR产物，纯化水，使总体积10y1。载体与各片段的用量满足其摩尔比2:1。 Infusion混合液37°C处理15分钟，50°C处理15分钟，加入40yITE缓冲液，补足50y1， 取2. 5 y