一种细胞共培养微流控芯片及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种微流控芯片及其应用，尤其涉及一种细 胞共培养微流控芯片及其应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤微环境对于肿瘤形成、发展、转移和复发具有重要作用。神经系统是组织微环 境的一个共同特征，但目前神经系统在肿瘤生长和发展中的认识仍较肤浅。已有报道，在动 物模型中，在肿瘤内及肿瘤周围的高密度神经生长可以帮助癌症的生长和扩散。之前的研 宄也曾表明癌细胞有时候会沿着神经迀移，但是对于其中具体的作用机制，科学家们尚不 十分了解。因此，建立肿瘤的神经微环境的体外模型，不仅有利于阐明神经在癌症生长和转 移中的作用，而且有可能引导我们进一步开发治疗癌症的新策略。
[0003] 细胞共培养技术能有效地模拟体内微环境，是目前细胞生物学的常用手段 之一。目前常用的细胞共培养装置需要联合使用昂贵的基质胶（Matrix gel)以及 Transwell培养小室。目前最常见的神经-癌细胞共培养体系主要是将神经元和癌 细胞分别接种于Matrigel?胶中，然后将这两种细胞置于同一培养环境中进行培养 和观察(Ayala et al. , In vitro dorsal root ganglia and human prostate cell line interaction!redefining perineural invasion in prostate cancer.The Prostate, 49 (3) : 213-23, 2001)。这种传统的培养装置存在诸多缺点：价格昂贵，细胞分布 不均，难以精确的模拟体内真实情况、操作难度大等。由于现有的共培养装置存在的种种缺 陷，因此急需研发一种更加便捷、实用、直观的细胞共培养装置。
[0004] 近年来，微流控芯片技术作为一门迅速发展的科学技术，已经在生物医学领域展 现了独特的优势。微流控芯片作为一种新型的研宄平台，具有高密度、高通量、集成化、样 品消耗量低、多重平行分析、便携式、成本低等优势，已经在生命科学研宄领域发挥着重要 的作用。比如图案化细胞共培养，其采用将不同细胞选择性地粘附在材料表面的不同区 域，来调控多种细胞之间的相互作用（Li et al.，A method for patterning multiple types of cells by using electrochemical desorption of self-assembled monolayers within microfluidic channels. Angew Chem Int Ed Engl. 46 (7) : 1094-6) 〇 特别是近年 来发展的区室化微流控芯片（microfluidic compartmentalized chip)，因其具有高度差 的区室化结构，可以精确控制神经突（树突和轴突）的区域化定向生长（Taylor et al.，A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods, 2 (8) : 599-605, 2005)，该技术为构建神经微环境提供可能，在神经细胞生 物学中被广泛采用。然而，利用类似的区室化微流控芯片同时完成神经-癌细胞的植入共 培养及研宄其相互作用，并进一步进行抗肿瘤药物的筛选研宄工作，在目前的应用领域尚 处于空白阶段。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种微流控芯片及其应用，特别是一种细胞共培养微流控 芯片及其应用。通过该细胞共培养微流控芯片可以构建肿瘤的神经微环境，为研宄肿瘤微 环境、神经-癌症相互作用的基本研宄以及抗肿瘤药物的筛选提供了平台。
[0006] 为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] 第一方面，本发明提供了一种细胞共培养微流控芯片，该微流控芯片包括培 养通道和微通道，所述培养通道通过微通道进行连接，其中，所述培养通道的高度为 100-300 y m，所述微通道的高度< 5 y m。
[0008] 本发明采用含有两层高度不同的嵌套微流控通道结构，并对其中微通道的高度进 行了特殊设计，使其高度控制在5 ym以内。该高度设计保证了微通道只允许神经突的生长 和通过，有助于诱导神经突的定向生长，以便直观地研宄在神经微环境中神经-癌细胞的 相互作用。
[0009] 本发明通过采用将培养通道和微通道设置成上述特定的高度比，由于培养通道的 高度限制，中间的微通道只允许神经突的生长和通过，而神经元胞体和癌细胞则被限制在 各自的培养通道中，从而形成区室化细胞共培养微流控芯片。
[0010] 本发明中，所述培养通道的高度为100_300 ym，例如可以是100ym、110ym、 120 u m、130 u m、140 u m、150 u m、160 u m、170 u m、180 u m、190 u m、200 u m、220 u m、250 u m、 280 u m、300 u m，优选为 150 u m。
[0011] 本发明中，所述微通道的高度< 5 um，例如可以是2 um、2. 2 um、2. 5 um、2. 8 um、 3 u m、3. 2 u m、3. 5 u m、3. 8 u m、4 u m、4. 2 u m、4. 5 u m、4. 8 u m、5 u m，1??? 5 u m。
[0012] 本发明中，所述培养通道的长度为l_2cm，例如可以是lcm、l. lcm、l. 2cm、l. 3cm、 L 4cm、L 5cm、L 6cm、L 7cm、L 8cm、L 9cm、2cm〇
[0013] 本发明中，所述培养通道的宽度为l_3mm，例如可以是lmm、l. 2mm、l. 5mm、l. 8mm、 2mm、2. 2mm、2. 5mm、2. 8mm、3mm〇
[0014] 本发明中，所述微通道的长度为300-500 um，例如可以是300 um、320 um、 350 u m、380 u m、400 u m、420 u m、450 u m、480 u m、500 u m。
[0015] 本发明中，所述微通道的宽度为3-5um，例如可以是3um、3. 2um、3. 5um、 3. 8 u m、4 u m、4. 2 u m、4. 5 u m、4. 8 u m、5 u m。
[0016] 本发明中，所述培养通道的间距为300-500 um，即为微通道的长度，例如可以是 300 u m、320 u m、350 u m、380 u m、400 u m、420 u m、450 u m、480 u m、500 u m。
[0017] 本发明中，所述微通道的间距为10-20um，例如可以是10um、llum、12um、 13 u m、14 u m、15 u m、16 u m、17 u m、18 u m、19 u m、20 u m。
[0018] 本发明中，所述细胞共培养微流控芯片的材料为聚二甲基硅氧烷（PDMS)材料。
[0019] 第二方面，本发明还提供了一种细胞共培养的方法，所述方法采用如本发明第一 方面所述细胞共培养微流控芯片。
[0020] 本发明中，所述细胞共培养的方法包括以下步骤：分别将神经细胞和癌细胞通入 不同的培养通道，并诱导神经突沿着微通道定向生长，构建神经-癌细胞共培养体系。
[0021] 优选地，所述神经细胞的密度为4\107-7父107(^11 8/1^，优选为6\107(^118/111匕
[0022] 优选地，所述癌细胞的密度为4X 106-7X 106cells/mL，优选为6X 106cells/mL。
[0023] 优选地，所述神经细胞和癌细胞通入位于微通道两侧不同的培养通道。
[0024] 作为优选的技术方案，本发明中所述细胞共培养的方法包括以下步骤：
[0025] (1)制备神经元的悬浮溶液，细胞密度为4X 107-7X 107cells/mL，恒温培养 30-60min后，神经元细胞贴壁在培养通道中，72-96h后，所述神经元细胞被限制在培养通 道中，形成神经元培养通道，并诱导神经突沿着微通道定向生长；
[0026] (2)制备癌细胞的悬浮溶液，细胞密度为4X 106-7X 106cells/mL，恒温培养6_8h 后，癌细胞贴壁在步骤（1)对面的培养通道中，所述癌细胞被限制在该培养通道中，形成癌 细胞培养通道；
[0027] (3)待神经突生长并达到对面的癌细胞培养通道时，揭去聚二甲基硅氧烷印章，在 开放体系下观察神经-癌细胞的相互作用。
[0028] 本发明的细胞共培养方法中，通过采用细胞共培养微流控芯片，可以有效建立神 经-癌细胞共培养体系，例如可以在微流控芯片两侧的培养通道中分别通入神经元和癌细 胞，中间连接微通道，该微通道可以诱导神经突的定向生长，研宄在神经纤维的引导下癌细 胞的迀移活动，从而明确了神经微环境中神经-癌细胞的相互作用，为研宄肿瘤生长和发 展提供了新思路。
[0029] 第三方面，本发明还提供了 一种药物筛选的方法，该方法采用如本发明第一方面 所述细胞共培养微流控芯片。
[0030] 有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
[0031] (1)本发明利用区室化微流控芯片技术来控制神经突的定向生长，模拟并构建肿 瘤的神经微环境，为研宄肿瘤微环境、神经-癌症相互作用的基本研宄提供了平台，同时还 可以用于基于细胞和细胞之间作用的药物检测，用以筛选相关神经药物的抗肿瘤效果，为 发现抗癌药物的分析提供了新的途径；
[0032] (2)本发明利用体外微流控芯片的研宄方法，便于观察，设备简单，样本和试剂用 量小，平行培养能力强，能更真实地反映人体肿瘤微环境中的神经系统的作用，有利于观察 细胞与细胞之间相互作用，也有利于快速筛选新药的疗效和毒性，在细胞生物学、肿瘤、药 物筛选等相关领域具有广泛的应用价值。
【附图说明】
[0033] 图1是本发明的细胞共培养微流控芯片的结构示意图；
[0034] 图2是基于微流控芯片的神经元-癌细胞共培养模型；
[0035] 其中，图2-a表示微流控芯片中含有中间连接的微通道，图2-b表示微流控芯片中 不含有中间连接的微通道；
[0036] 图3表示癌细胞在有/无神经突引导下的迀移情况；
[0037] 其中，图3-a表示癌细胞在有神经突引导下的迀移情况，图3-b表示癌细胞在无神 经突引导下的迀移情况，图3-c表示癌细胞在有/无神经突引导下的平均迀移距离比较；
[0038] 图4表示癌细胞在有/无神经损伤时的迀移情况；
[0039] 其中，图4-a表示无神经损伤时癌细胞的迀移情况，图4-b表示用化学方法诱导神 经纤维的损伤，癌细胞在24