大黄鱼白细胞介素8基因大肠杆菌表达产物及制备与应用

文档序号:8294971阅读:398来源:国知局
大黄鱼白细胞介素8基因大肠杆菌表达产物及制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及大黄鱼白细胞介素8(IL-8)基因,尤其是涉及一种大黄鱼白细胞介素 8基因大肠杆菌表达产物及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 趋化因子属于细胞因子家族,在炎症反应或正常生理条件下调控免疫细胞的 迀移,调控所富集细胞的免疫反应和分化,是先天性免疫和获得性免疫反应之间的桥梁 (Esche C, Stellato C, Beck LA. Chemokines:key players in innate and adaptive immunity [J]. J Invest Dermatol, 2005, 125 (4): 615-628)。趋化因子还可以调控免 疫细胞在淋巴器官间的定位和分化、血管生成、神经系统发育、器官生成以及生殖细 胞迁移等(DeVries ME,Kelvin AA,Xu L,Ran L,Robinson J, Kelvin DJ. Defining the origins and evolution of the chemokine/chemokine receptor system[J]. J Immunol,2006, 176(1) :401-415)。根据前两个保守的半胱氨酸残基的排列将趋化因子分为 四个亚家族:CXC型、CC型、CX3C型和C型。
[0003] 白细胞介素8 (Interleukin-8, IL-8)属于CXC型趋化因子,是鱼类中功能 试验进展较多的一个趋化因子。IL-8不仅可以趋化嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、静 息T细胞和刺激后的嗜酸性粒细胞,而且可以通过诱导呼吸爆发、胞吐等作用活化这些 细胞(van der Aa LM, Chadzinska M, Tijhaar E, Boudinot P, Verburg-van Kemenade BM. CXCL8chemokines in teleost fish:two lineages with distinct expression profiles during early phases of inflammation [J]. PloS one. 2010, 5: el2384) 〇 虹蹲 的IL-8重组蛋白体外可以趋化中性粒细胞,并且像哺乳动物一样,并能引起目的细胞呼 吸爆发反应(Harun NO, Zou J, Zhang YA, Nie P, Secombes CJ. The biological effects of rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)recombinant interleukin-8[J]. Dev Comp Immunol, 2008, 32(6) :673-681)。此外,IL-8还可以诱导CC型趋化因子如CK-6以及促炎 症因子IL-I 0、TNF-a的表达。

【发明内容】

[0004] 本发明的第一目的在于提供可高效表达大黄鱼白细胞介素8基因的大肠杆菌工 程菌。
[0005] 本发明的第二目的在于提供大黄鱼白细胞介素8基因大肠杆菌表达产物及其制 备方法。
[0006] 本发明的第三目的在于提供大黄鱼白细胞介素8重组蛋白的应用。
[0007] 所述可高效表达大黄鱼白细胞介素8基因的大肠杆菌工程菌为大肠杆菌 (Escherichia coli)BL21/pET-His-IL-8,已于2015年1月21日保藏于中国典型培养物 保藏中心,保藏中心的地址为中国,武汉,武汉大学,邮编:430072,保藏编号为CCTCC NO :M 2015053。
[0008] 所述大黄鱼白细胞介素8基因大肠杆菌表达产物为分子量约IOkDa(kilodalton, 千道尔顿)的大黄鱼IL-8重组蛋白,该大黄鱼IL-8重组蛋白在终浓度为100 y g/mL时,对 大黄鱼外周血白细胞具有较为明显的趋化作用,并具有诱导大黄鱼外周血白细胞产生呼吸 爆发的活性,显示出其在水产免疫增强剂研发中的良好应用前景。
[0009] 所述大黄鱼白细胞介素8基因的CDNA序列及推断的氨基酸序列如下:
【主权项】
1. 可高效表达大黄鱼白细胞介素8基因的大肠杆菌工程菌,其特征在于为大肠杆菌 (Escherichiacoli)BL21/pET-His-IL-8,已于2015年1月21日保藏于中国典型培养物保 藏中心,保藏编号为CCTCCNO:M2015053。
2. 大黄鱼白细胞介素8基因大肠杆菌表达产物,其特征在于为分子量约10kDa的大黄 鱼IL-8重组蛋白。
3. 大黄鱼白细胞介素8基因的cDNA序列及推断的氨基酸序列如下:
其中,下划线部分为预测的大黄鱼IL-8信号肽;阴影部分标示推断的大黄鱼IL-8成熟 肽序列;星号表示终止密码子。
4. 如权利要求2所述大黄鱼白细胞介素8基因大肠杆菌表达产物的制备方法,其特征 在于包括以下步骤: 1) 克隆大黄鱼IL-8基因全长cDNA序列,再采用PCR技术扩增出编码第23?99位氨 基酸的大黄鱼IL-8成熟肽基因片段; 2) 将步骤1)得到的大黄鱼IL-8成熟肽基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET-His, 得到含大黄鱼IL-8基因片段的重组表达载体pET-His-IL-8 ; 3) 将重组表达载体pET-His-IL-8转化大肠杆菌BL21菌株,经氨苄青霉素筛选 及测序鉴定后,获得含有大黄鱼IL-8基因片段的大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21/ pET-His-IL-8 ;同时,表达载体pET-His转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21/pET-His-IL-8,获得的大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21/pET-His-IL_8 作为对照菌株; 4) 将步骤3)获得的大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21/pET-His-IL-8在LB培养基中 经IPTG诱导、振荡培养,将培养物离心收集菌体,BufferA重悬后,超声破碎,分别收集菌 体裂解液上清和菌体裂解液沉淀,经聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE分析证明大黄鱼IL-8 重组蛋白以包涵体形式表达; 5) 利用镍离子鳌合亲和层析介质(Ni-NTA)纯化大黄鱼IL-8重组蛋白:离心收集大肠 杆菌(Escherichiacoli)BL21/pET-His-IL_8培养物中菌体,用包涵体洗绦液重悬菌体,第 1次超声破碎,离心收集沉淀,再用包涵体裂解液重悬沉淀,第2次超声破碎,离心收集上清 后上柱,4°C结合2h,用杂蛋白洗涤液洗柱,再用尿素洗柱,最后用变性蛋白洗脱液洗脱,获 得大黄鱼IL-8重组蛋白,纯化后的大黄鱼IL-8重组蛋白分别经缓冲液B、缓冲液C、缓冲液 D进行3步透析,即得到具有生物学活性的大黄鱼IL-8重组蛋白;缓冲液B的组成为:3M尿 素、20mMTris-HCl、150mMNaCl、0. 25M咪唑、0.ImM氧化型谷胱甘肽、0. 5mM还原型谷胱甘 肽、5%甘油和0.005%1¥661120;缓冲液(:的组成为 :1]\1尿素、2011111^8-11(:1、150福恥(:1、 0. 125M咪唑、0.ImM氧化型谷胱甘肽、0. 5mM还原型谷胱甘肽、5%甘油和0. 005%Tween20 ; 缓冲液D的组成为:20mMTris-HCl、150mMNaCl和5%甘油。
5. 如权利要求4所述大黄鱼白细胞介素8基因大肠杆菌表达产物的制备方法,其特征 在于在步骤4)中,所述LB培养基的组成为:10g/L蛋白胨、5g/L酵母抽提物、10g/L氯化钠; 所述IPTG的摩尔浓度可为0.ImM;所述振荡培养的条件可于37°C振荡培养4h。
6. 如权利要求4所述大黄鱼白细胞介素8基因大肠杆菌表达产物的制备方法,其特 征在于在步骤 4)中,所述BufferA的组成为:20mMTris-HCl、150mMNaCl、0.5%Triton X-100 和 30mM咪唑,pH7. 9。
7. 如权利要求4所述大黄鱼白细胞介素8基因大肠杆菌表达产物的制备方法,其特征 在于在步骤5)中,所述包涵体洗涤液的组成为:2M尿素、20mMTris-HCl、150mMNaCl、lmM EDTA和0. 5%TritonX-100,pH7. 9 ;所述第1次超声破碎的时间可为lOmin。
8. 如权利要求4所述大黄鱼白细胞介素8基因大肠杆菌表达产物的制备方法,其特 征在于在步骤5)中,所述包涵体裂解液的组成为:8M尿素、20mMTris-HCl、150mMNaCl、 0. 1% 0 -巯基乙醇、0. 2%TritonX-100和30mM咪唑,pH7. 9 ;所述第2次超声破碎的时 间可为5min。
9. 如权利要求4所述大黄鱼白细胞介素8基因大肠杆菌表达产物的制备方法,其特 征在于在步骤5)中,所述杂蛋白洗涤液的组成为:6M尿素、20mMTris-HCl、150mMNaCl、 0. 1% 0 -巯基乙醇和30mM咪唑,pH6. 0 ;所述尿素洗柱可采用用6M尿素洗柱;所述变性 蛋白洗脱液的组成可为:6M尿素、20mMTris-HCl、150mMNaCl和0. 5M咪唑,pH4. 5。
10. 如权利要求2所述大黄鱼IL-8重组蛋白在制备水产免疫增强剂中应用。
【专利摘要】大黄鱼白细胞介素8基因大肠杆菌表达产物及制备与应用,涉及大黄鱼白细胞介素8基因。表达大黄鱼白细胞介素8基因的工程菌为大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET-His-IL-8。大黄鱼白细胞介素8基因大肠杆菌表达产物为大黄鱼IL-8重组蛋白。克隆大黄鱼IL-8基因全长cDNA序列,扩增出编码第23~99位氨基酸的大黄鱼IL-8成熟肽基因片段,再克隆到大肠杆菌表达载体pET-His,得到含大黄鱼IL-8基因片段的重组表达载体pET-His-IL-8,然后转化大肠杆菌BL21菌株,经筛选及测序鉴定后得含有大黄鱼IL-8基因片段的大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET-His-IL-8,经IPTG诱导培养,离心收集菌体,重悬,破碎,收集菌体裂解液上清和菌体裂解液沉淀;纯化大黄鱼IL-8重组蛋白。大黄鱼IL-8重组蛋白可在制备水产免疫增强剂中应用。CCTCC NO:M 201505320150121
【IPC分类】C07K1-22, C12N15-24, C12N1-21, C07K14-54, C12N15-70, A61P37-04, A61K38-20, C12R1-19
【公开号】CN104611287
【申请号】CN201510069252
【发明人】陈新华, 母尹楠, 敖敬群
【申请人】国家海洋局第三海洋研究所
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年2月10日
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